Fotosíntesis fácil de porfirina novedosa

May 01, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8580 (2023) Citar este artículo

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En esta investigación, la síntesis en un solo paso de nuevos nanocompuestos basados ​​en porfirina se realizó fácilmente utilizando una estrategia de iluminación fotoquímica bajo luz visible. Como resultado, el enfoque de esta investigación es sintetizar y utilizar nanopartículas decoradas de ZnTPP (zinc(II)tetrakis(4-fenil)porfirina) con nanoestructuras de Ag, Ag/AgCl/Cu y Au/Ag/AgCl como agentes antibacterianos. Inicialmente, las NP de ZnTPP se sintetizaron como resultado del autoensamblaje de ZnTPP. En el siguiente paso, en un proceso fotoquímico de irradiación de luz visible, las nanopartículas de ZnTPP autoensambladas se usaron para fabricar ZnTPP/Ag NC, ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC. Se realizó un estudio de la actividad antibacteriana de los nanocompuestos para Escherichia coli y Staphylococcus aureus como microorganismos patógenos mediante el método de recuento en placa, pruebas de difusión en pozos, determinación de los valores de concentración mínima inhibitoria (MIC) y concentración mínima bactericida (MBC). A partir de entonces, las especies reactivas de oxígeno (ROS) se determinaron por el método de citometría de flujo. Todas las pruebas antibacterianas y las mediciones de ROS de citometría de flujo se realizaron bajo luz LED y en la oscuridad. Se aplicó el ensayo de bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) para investigar la citotoxicidad de las NC de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu contra fibroblastos de prepucio humano (HFF- 1) células normales.Debido a las propiedades específicas, como las propiedades fotosensibilizantes admisibles de la porfirina, las condiciones de reacción suaves, las propiedades antibacterianas altas en presencia de luz LED, la estructura cristalina y la síntesis verde, estos nanocompuestos fueron reconocidos como tipos de materiales antibacterianos que son activado en luz visible, obtuvo el potencial para su uso en una amplia gama de aplicaciones médicas, terapia fotodinámica y tratamiento de agua.

En los últimos años, los logros experimentales e industriales en nanotecnología han generado un nuevo enfoque en las ciencias aplicadas, lo que ha resultado en el crecimiento de actividades interdisciplinarias en la industria, el medio ambiente y la medicina1,2,3. Debido a la importancia de prevenir el daño bacteriano dañino, se están desarrollando agentes antibacterianos. Como resultado, los nanomateriales son tratamientos considerados muy beneficiosos debido a sus cualidades particulares contra las infecciones bacterianas causadas por el mal uso de antibióticos, lo que ha llevado a la resistencia bacteriana y una amenaza global para la salud humana. Además, la creación de agentes antibacterianos biocompatibles es uno de los temas más apremiantes para los científicos4,5. E. coli es un patógeno pernicioso y un bacilo gramnegativo. Además, la erradicación de E. coli se está volviendo cada vez más desafiante. Los seres humanos contraen diarrea a causa de las bacterias Staphylococcus aureus (grampositivas) y Escherichia coli (gramnegativas) después de beber agua contaminada. Como resultado, un suministro de agua potable saludable es fundamental para la salud humana6,7.

La robusta estructura macrocíclica del núcleo de porfina lo convierte en un buen punto de anclaje para la complejación de átomos metálicos8,9. Los estudios de síntesis, estructura, ensamblajes y aplicaciones de porfirinas siempre han intrigado a la comunidad científica10. Las porfirinas son especies de supramoléculas y tienen una amplia gama de propiedades fotofísicas y fotoquímicas, altas eficiencias de fotosensibilización, energía superior, capacidades de transferencia de electrones y un excelente potencial de captación de luz, incluida una fuerte absorción de luz en la región visible, mientras que sus niveles de energía se pueden ajustar fácilmente a hacer coincidir los de los materiales donantes utilizando un diseño molecular adecuado11,12. Las porfirinas también se utilizan ampliamente en la terapia fotodinámica antimicrobiana13,14,15.

La porfirina expuesta a la luz puede generar radicales libres, o más probablemente oxígeno singulete. Este proceso depende del tipo de porfirina empleada como fotosensibilizador y fuente de luz. Estas especies son extremadamente reactivas y pueden interactuar con casi todos los componentes celulares, incluidas las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos. Algunos subproductos reactivos, como especies reactivas de oxígeno, pueden producirse como resultado de esta interacción (ROS). Estas especies pueden causar más daño y muerte celular16.

Se ha demostrado que las nanopartículas metálicas, en particular las nanopartículas de plata (Ag), son potentes agentes antibacterianos con una amplia gama de actividad antibacteriana17,18. Los nanomateriales, incluido el cobre, son de gran interés debido a su amplia disponibilidad, bajo costo y similitudes con las características de los metales nobles. También puede ser utilizado como agente bactericida y antimicrobiano para recubrir equipos hospitalarios19,20. Las nanopartículas de oro (Au NP) están emergiendo como candidatos ideales debido a su importante eficacia biomédica21,22. Al combinar materiales con propiedades potenciales, se pueden crear nuevos materiales con un rendimiento mejor y más efectivo. En este trabajo, sintetizamos nanocompuestos de múltiples componentes que contienen nanoestructuras de ZnTPP y varios componentes metálicos en forma de ZnTPP/Ag NC, ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC mediante el uso del método fotoquímico. Además, probamos la eficacia de estas nanopartículas al examinar estas nanopartículas a través de la luz de una lámpara LED en dos tipos de bacterias patógenas humanas. Además, una ventaja importante de este nanocompuesto es la mejor eliminación de E. coli en comparación con la bacteria S. aureus en presencia de luz, lo que se puede mencionar para los estudios de terapia fotodinámica. Además, el potencial antibacteriano de los nanocompuestos sintetizados también se estudió utilizando el método MIC contra los microorganismos resistentes a los medicamentos más comunes en el campo médico, que se examinó en la oscuridad y con luz LED en presencia de nanocompuestos. El efecto sinérgico de estos metales se investigó en el enfoque disponible y se recomendó como un método viable para su uso en la eliminación de contaminantes bacterianos del agua potable y propiedades medicinales (Fig. 1).

Preparación esquemática de ZnTPP/Ag NC, ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC.

Cada uno de los químicos utilizados en este trabajo fue de agentes de grado analítico. Nitrato de plata (AgNO3), ácido tetracloroáurico (III) trihidrato (HAuCl4·3H2O), cloruro de cobre dihidrato (CuCl2·2H2O), hidróxido de sodio (NaOH), ácido clorhídrico (HCl 37%), azul de metileno (MB), etanol 96 %, pirrol (CH4NCH3) y ácido propiónico (C3H6O2) se prepararon de Merck Company. Para la metalación de porfirina, también se adquirieron de Merck Company acetato de zinc dihidratado (Zn(CH3CO2)2·2H2O) y dimetilformamida (DMF). Se prepararon bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), ácido l-ascórbico (AA) y ácido poliacrílico (PAA) de Sigma-Aldrich Company. Para la preparación de las soluciones se utilizó agua desionizada. Todos los reactivos se aplicaron sin más purificación excepto el pirrol, que primero se destiló y utilizó para la síntesis de porfirina.

El análisis de difracción de rayos X en polvo (PXRD) se realizó en un difractómetro de rayos X en polvo D Jeoljdx-8030 con radiación Cu Kα (l = 0,154 nm) (40 kV, 30 mA). Para la investigación morfológica de los nanocompuestos y el análisis elemental, EDS Semicuantitativo y análisis de barrido de mapas, se utilizó el microscopio electrónico de emisión de campo MIRA3 TESCAN—XMU (FE-SEM). Mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión (modelo: EM 208S) A 100 kV, se determinaron las nanopartículas. Para la síntesis fotocatalítica, la lámpara Halógena incandescente (DONAR DN-30059, 82 V, 360 W). Los análisis infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) se utilizaron en un espectrofotómetro Shimadzu FTIR-8400S utilizando un sedimento de KBr para la preparación de la muestra. Para detectar la estructura de la porfirina, se utilizó un espectrómetro UV-visible de doble haz (Shimadzu UV-1700) a temperatura ambiente en el rango de 400 a 700 nm.

La tetrafenil porfirina (H2TPP) se sintetizó según el procedimiento de Adler23, en primer lugar se destiló el pirrol. Luego, 9 mmol de cada pirrol destilado y benzaldehído se sometieron a reflujo durante 4 h en 170 ml de ácido propiónico. La purificación del producto se realizó mediante columna cromatográfica. A partir de ahí, para preparar ZnTPP, 1 mmol de H2TPP preparado y 2 mmol de Zn(Ac)2 se sometieron a reflujo en 70 ml de DMF (155 °C) durante 6 h24.

Las nanopartículas de ZnTPP se prepararon mediante procedimientos de autoensamblaje de neutralización ácido-base. En esta ruta, la solución dispersa de 10 mL de ZnTPP (0,1 M) en solución de HCl (0,2 M) se inyectó en 19 mL de solución acuosa agitada de bromuro de cetrimonio (CTAB), (0,01 M) y NaOH (0,008 M) a Condiciones STP. Se continuó agitando la mezcla durante 40 min, luego se centrifugó a 10.000 rpm, se lavó con agua desionizada y se secó.

Para la síntesis de ZnTPP/Ag NCs, se mezclaron en un vial de vidrio 2 mL de solución de AgNO3 (50 mM) con 0,5 mL de la solución de ácido l-ascórbico (0,1 M) y 10 mL de nanoestructuras de ZnTPP dispersas (0,15 mM). y se agitó durante 10 min bajo una lámpara de luz halógena (360 Watt, 82 Volt). El producto se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min y luego se lavó con agua desionizada y se secó. El compuesto obtenido, ZnTPP/Ag NCs, se denominó A.

El ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC se sintetizó mediante la adición en un solo paso de 1 mL de solución de AgNO3 (50 mM), 1 mL de solución de CuCl2 (50 mM), 0,5 mL de la solución de ácido l-ascórbico ( 0,1 M) y 10 ml de nanoestructuras ZnTPP dispersas (0,15 mM) en un vial de vidrio. Y se agitaron bajo una lámpara de luz halógena (360 Watt, 82 Volt) durante 10 min. El lavado del sedimento con agua desionizada y secado condujo a la obtención del nanocompuesto ZnTPP/Ag/AgCl NCs al que se denominó "B".

Los NC de ZnTPP/Au/Ag/AgCl se sintetizaron mediante la adición en un solo paso de 1 mL de solución de HAuCl4·3H2O (50 mM), 1 mL de solución de AgNO3 (50 mM), 1 mL de solución de CuCl2 (50 mM) , 0,5 mL de la solución de ácido l-ascórbico (0,1 M), y 10 mL de nanoestructuras ZnTPP dispersas (0,15 mM) en un vial de vidrio bajo agitación y lámpara halógena durante 10 min. Luego, el sedimento se lavó con agua desionizada y se secó. Este nanocompuesto se denominó "G".

Para las pruebas antimicrobianas, las cepas de Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923) se compraron del banco de microorganismos de la Organización de Investigación Industrial Científica de Irán.

La línea celular de fibroblastos de prepucio humano (HFF-1) se compró del banco celular nacional de Irán (Pasture Institute, Teherán, Irán).

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el paquete de software SPSS v16.0.

En esta investigación y en la continuación de nuestra investigación reciente en nanotecnología25,26,27, se sintetizaron nanocompuestos mono y bimetálicos mediante una estrategia simple con un solvente ecológico y ecológico. En la síntesis de nanocompuestos bimetálicos a base de porfirina, utilizamos los valores de la relación de consumo de sal de la siguiente manera (Fig. 1): se utilizó el 100 % de AgNO3 (50 mM) como solución salina en la síntesis del " Un nanocompuesto. En la síntesis del nanocompuesto "B" se aplicó 50% de AgNO3 con 50% de CuCl2·2H2O. Al utilizar el 33 % de AgNO3, el 33 % de CuCl2·2H2O y el 33 % de las sales HAuCl4·3H2O en la síntesis del nanocompuesto, obtuvimos el compuesto que se atribuyó a las NC ZnTPP/Au/Ag/AgCl ("G " nanocompuesto).

Se estudió la identificación de las propiedades de los nanocompuestos sintetizados en términos de espectro EDX, análisis de mapeo, espectroscopia UV-Vis, imágenes FE-SEM, patrón PXRD, análisis FT-IR e imágenes TEM. Además, las propiedades antibacterianas se estudian mediante un método de difusión en disco de agar, MIC, MBC y contador de colonias en presencia de nanocompuestos con luz LED y oscuridad. El papel de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en el mecanismo antibacteriano de los NC ZnTPP/Ag/AgCl/Cu, el nanocompuesto con el mejor resultado antibacteriano, se estudió mediante citometría de flujo tanto en luz LED como en oscuridad. La citotoxicidad de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC se evaluó en células de fibroblastos de prepucio humano (HFF-1) mediante la prueba MTT.

Como se muestra en la Fig. 2Ab, el patrón de difracción de rayos X de polvo de ZnTPP autoensamblado (ZnTPP NP) reveló los picos de difracción en (001), (110), (200), (112), (020), (201) , (400), (130) correspondientes a los datos de la estructura cristalina publicada (CCDC, código de referencia ZNTPOR03) octaedros simulados que se muestran en la Fig. 2Aa 28. En el patrón XRD de ZnTPP/Ag NC (Fig. 2Ac) se indicaron cuatro picos agudos en 2θ = 38,24°, 44,44°, 64,69°, 77,64° correspondientes a (111), (200), (220) y (311) superficies cristalinas de nanopartículas de Ag, respectivamente29,30. La Figura 2Ad demuestra el patrón XRD que se atribuyó a los NC ZnTPP/Ag/AgCl/Cu. Los picos a 27,96°, 32,40°, 46,40°, 54,96°, 57,64° se pueden asignar a las superficies cristalinas de AgCl (111), (200), (220), (311), (222), (400)31. Además, los picos en 2θ = 38,32°, 44,40° y 77,64° se atribuyeron a los planos (111), (220), (111) de nanopartículas metálicas de Ag32. Dado que la cantidad de cobre en los ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC sintetizados estaba por debajo del 5 % en peso según el análisis EDS, los picos de cobre no se ven en el patrón XRD de la muestra (Fig. 2Ad).

(A) PXRD de un patrón simulado de ZnTPP NP (a), ZnTPP NP (b) 42, ZnTPP/Ag NC (c), ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC (d), ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC (e), (B): espectros UV-Vis de H2TPP (a), ZnTPP (b), ZnTPP NP (c)42, ZnTPP/Ag/AgCl NC (d), ZnTPP/Ag NC (e), ZnTPP/ Au/Ag/AgCl NC (f), (C): espectros FT-IR de H2TPP (a), ZnTPP (b), ZnTPP NP (c)42, ZnTPP/Ag NC (d), ZnTPP/Ag/AgCl/ Cu NC (e), ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC (f).

En el patrón XRD que se muestra en la figura 2Ae, los picos a 29,68°, 56,68° y 59,32° especifican los planos de reflexión de AgCl (111), (311) y (222). Además, los picos a 39,96°, 48,12° y 78,66° pueden atribuirse a (111), (220) y (311) superficies cristalinas de nanopartículas de Au y Ag36. Así se consideró la formación de ZnTPP/Au/Ag/AgCl NCs. Hacia el patrón de difracción de rayos X de ZnTPP/Ag NC, ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC, probablemente después de la formación de nanocompuestos, la alternancia de las superficies cristalinas y la morfología de ZnTPP NP fue visto. El estudio espectroscópico de absorción electrónica para la porfirina libre de metales (H2TPP) ha revelado las bandas típicas de Soret y Q a 420, 516, 550, 592 y 560 nm respectivamente (Fig. 2Ba). La banda de Soret es una banda intensa que oscila alrededor de los 400 nm y es común para todas las porfirinas. Además, las bandas más débiles en la región de 500 a 600 nm que son bandas cuádruples para la base libre de porfirina y bandas dobles para las metaloporfirinas son bandas Q. En la coordinación de zinc y la formación del complejo metálico, aparecieron la banda de Soret a 421,5 nm y dos bandas Q débiles a 557 y 596 nm. Además, después de la complejación del metal, se produjo un desplazamiento hacia el rojo en la banda de Soret. El aumento de la simetría molecular de D2h a D4h condujo a un cambio en el número de bandas Q de cuatro a dos en el complejo metálico que confirmó la formación de ZnTPP (Fig. 2Bb). El espectro UV-Vis para ZnTPP agregado (ZnTPP NP) se demuestra en la Fig. 2Bc. Se observan significativamente las bandas anchas. Parece que la existencia de la coordinación metal-ligando y las interacciones de apilamiento π-π implican el ajuste de las agregaciones. Además, en los espectros de absorción electrónica de otros compuestos de nanoestructura agregada, ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC, ZnTPP/Ag NC y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC, la banda Soret a 421,5 nm y dos bandas Q débiles a 557 y 596 nm (Fig. 2Bd-f) respectivamente. Como se muestra en la Fig. 2Ca-f, los espectros IR de H2TPP, ZnTPP, ZnTPP NP, ZnTPP/Ag NC, ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC, ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC y se demostraron respectivamente. Además, se sabe que las nanopartículas de Ag y Au tienen los picos de absorción en la región de los picos Soret (alrededor de 420 nm) y Q (500–650 nm) de los compuestos de metaloporfirina respectivamente37,38,39. Por lo tanto, la posibilidad de la superposición de la absorción de nanopartículas de plata con el pico de Soret parece lógica en los NC ZnTPP/Ag, NC ZnTPP/Ag/AgCl/Cu, NC ZnTPP/Au/Ag/AgCl.

Las señales observadas a 2850 y 2921 cm−1 en los espectros infrarrojos de H2TPP, ZnTPP y ZnTPP NP, y todos los compuestos porfirínicos, asignados al modo de estiramiento vibratorio de C–H alifático, y señales a 1265 y 1000–1350 cm− 1 indicó el modo vibracional de C–N. La presencia de las señales en 3317 y 966 cm−1 se asigna a la vibración de estiramiento y flexión de N–H dentro del anillo de pirrol, respectivamente. Además, la no aparición de estas dos señales en los espectros de ZnTPP indica la coordinación del zinc en el complejo. La no aparición de estas dos señales en los espectros de ZnTPP indica la coordinación del zinc en el complejo. Además, con respecto al espectro de H2TPP, la señal en 1606 cm−1, que se atribuye a la vibración de estiramiento C=N del pirrol, se divide en dos picos alrededor de 1595 y 1652 cm−1, lo que indica la presencia de la coordinación Zn–N banda en los espectros de las NP ZnTPP preparadas que se han desplazado a la formación de nanocompuestos 1630 y 175024,40,41,42.

Las imágenes FE-SEM de las NP de ZnTPP sintetizadas se demostraron en la Fig. S1 complementaria que confirma la morfología octaédrica de las NP de ZnTPP. La figura 3a-c muestra las imágenes FE-SEM de ZnTPP/Ag NC. Se ilustró la existencia de la forma esférica de las nanopartículas de Ag. Se logró la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS) general y puntual (Fig. 3d-f). Además, en la Fig. 4a-f se muestra el análisis de mapeo elemental de ZnTPP/Ag NC preparados que indica la presencia de Ag NP con una distribución específica. Las imágenes FE-SEM y el análisis EDS de ZnTPP / Ag / AgCl / Cu NC sintetizados se mostraron en la Fig. 5a-c y la Fig. 5d-f respectivamente. En la investigación morfológica de nanoestructuras, se observa el aspecto cúbico de las partículas que se atribuye a los compuestos de Cu en consonancia con el análisis de mapeo elemental de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC preparados (Fig. 6a-g). Además, otras nanopartículas obtenidas del distrito de Ag se atribuyen a la existencia de nanopartículas de Ag y AgCl comparadas con los resultados de los análisis EDS y XRD. En las imágenes FE-SEM de ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC, se observa la presencia de nanopartículas de Au (Fig. 7a-c). El análisis EDS general y puntual obtenido confirma los distritos particulares que contienen nanopartículas de AgCl y Au individualmente (Fig. 7d-f). La distribución específica de las nanopartículas se especificó en el análisis de mapeo elemental de las NC ZnTPP/Au/Ag/AgCl preparadas (Fig. 8a-h).

La imagen FE-SEM de ZnTPP/Ag NC (a–c) y los espectros EDS generales y puntuales de ZnTPP/Ag NC (d–f).

Espectros de mapeo elemental de ZnTPP / Ag NC (a–f).

La imagen FE-SEM de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC (a–c) y los espectros EDS generales y puntuales de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC (d–f).

Espectros de mapeo elemental de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC (a–g).

La imagen FE-SEM de ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC (a–c) y los espectros EDS generales y puntuales de ZnTPP/Au/Ag/AgCl NC (d–f).

Espectros de mapeo elemental y de ZnTPP / Au / Ag / AgCl NC (ah).

La recopilación de imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC, el nanocompuesto sintetizado con el mejor rendimiento antibacteriano, condujo a la investigación del tamaño y la morfología de las partículas de este nanocompuesto. Las nanopartículas con alrededor de 5 a 10 nm se observan interconectadas con la estructura del nanocompuesto (Fig. 9a-f). La evaluación de los resultados del análisis con las imágenes FE-SEM y TEM obtenidas juntas confirma la formación de los nanocompuestos multicomponente obtenidos.

Imágenes TEM de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC en la escala de 500 nm (a), 200 nm (b, c), 150 nm (d), 100 nm (e) y 50 nm (f).

Las muestras y la cristalería se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min antes de cada prueba microbiológica. El pH medio se mantuvo en aproximadamente 7,4, que es el pH fisiológico. El experimento bactericida incluyó microorganismos Gram-negativos y Gram-positivos como S. aureus (ATCC 25923) y E. coli (ATCC 25922). Para las pruebas de conteo de colonias, MBC y el método de la zona de inhibición, se utilizaron placas que contenían agar Mueller-Hinton como medio de crecimiento de microorganismos, también se utilizó medio Nutrient Broth para MIC, así como la turbidez de 0.5 McFarland como estándar para el prueba antibacteriana. Se ha propuesto que las especies de oxígeno reactivo intracelular (ROS) desempeñan funciones críticas en el mecanismo antimicrobiano. En este sentido, el efecto de los tratamientos de ZnTPP/Ag/AgCl NC sintetizados en ROS intracelulares para S. aureus (ATCC 25923) y E. coli (ATCC 25922) también se investigó mediante citometría de flujo en condiciones de luz y oscuridad.

Para investigar la actividad antibacteriana, se utilizó el método de difusión en pozos de agar más práctico. Por lo tanto, la difusión en pozo de agar se puede utilizar para probar la susceptibilidad microbiana a estas concentraciones de 1 ml (10 mg) de nanocompuestos en presencia de estas dos bacterias patógenas a 37 °C durante 24 h, se utilizó agar Muller-Hinton como base. medio así como un medio de crecimiento sólido para microorganismos. En primer lugar, se generaron suspensiones de turbidez de 0,5 McFarland de estas dos bacterias. Aproximadamente 20 cc del medio se colocan asépticamente en placas de Petri desinfectadas después de enfriar. Utilizando un palo de hockey de vidrio estéril, el cultivo (la concentración celular se ajustó a 107 células/mL) se dispersó por la superficie de las placas de agar solidificadas. En consecuencia (Fig. S2 complementaria). Las ZOI (zonas de inhibición) que rodean las muestras analizadas en círculo evalúan su eficacia antibacteriana contra dos patógenos importantes, E. coli y S. aureus. Las zonas de inhibición del diámetro obtenidas se representan en la Tabla complementaria S1. Los resultados de las zonas de inhibición del diámetro para E. coli y S. aureus en condiciones de oscuridad y luz se representaron en los gráficos de columnas de la Fig. 10.

Gráficos de columnas que representan las cantidades de la zona de inhibición del diámetro para S. aureus y E. coli, en presencia de A (ZnTPP/Ag NC), B (ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC) y G (ZnTPP/ Au/Ag/AgCl NCs), en oscuridad y luz LED después de 24 h.

En este estudio, por primera vez, seleccionamos dos microplacas de 96 pozos para el estudio de MIC y MBC con luz LED y oscuridad en dos tipos de bacterias patógenas E.coli y S. aureus, en presencia de ZnTPP/Ag NCs (A), ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NCs (B), y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NCs (G), con método de dilución seriada, considerando que el primer pozo tuvo la mayor concentración de 5000 ppm (µg/mL ) y finalmente, clasificamos el último pozo con la concentración más baja de nanocompuesto de 9.7 ppm (µg/mL) y finalmente agregamos (1 × 105 CFU/mL) bacterias a cada pozo al medio de cultivo Muller Hinton Broth (MHB) en ambos 96 -bien microplacas. Un pocillo siempre tenía sólo el medio de cultivo que contenía bacterias para controlar. Luego se colocó una microplaca de 96 pocillos en luz LED durante 2 h y otra microplaca se colocó en la oscuridad durante 2 h, luego la microplaca se incubó durante aproximadamente 18 h a 37 °C, luego de 6 casas que tenían un cultivo de caldo claro con el fin de Determinación de la concentración de nanocompuestos u otras palabras, MIC y MBC se vertieron en una placa que contenía Casein-peptone Soymeal-peptone Agar (CASO Agar) y después de 24 h a 37 ° C en una incubadora (Fig. 11a, b, Figs. S3 complementarias , S4) respectivamente.

(a) Fotografías de las microplacas MIC de 96 pocillos y (b) placas MBC para E. coli y S. aureus en presencia de nanocompuestos expuestos a LED.

Los resultados de la prueba MIC en condiciones de oscuridad y luz para E. coli y S. aureus se evaluaron en las Tablas complementarias S2 y S3, respectivamente. Se seleccionó una microplaca de pocillos en la que las bacterias no crecían como medios MBC y la concentración bactericida más baja de bacterias nanocompuestas y se seleccionó la microplaca antes de MBC como la concentración inhibitoria bactericida más alta MIC. La Figura 11b, la Figura complementaria S4 y las Tablas complementarias S4 y S5 representan las placas MBC y sus valores de resultado, respectivamente. Finalmente, el nanocompuesto ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NCs (B) tuvo la mayor potencia antibacteriana en comparación con los nanocompuestos ZnTPP/Ag NCs (A) y ZnTPP/Au/Ag/AgCl NCs (G). Ambas bacterias patógenas se reportaron como grampositivas y gramnegativas. Las muestras A y B se observaron en la exposición a la luz LED con más propiedades antibacterianas que en el estado oscuro y los nanocompuestos G en el estado oscuro con más poder antibacteriano que la irritación de la luz LED. La Figura 12 demuestra los resultados de los valores MIC y MBC obtenidos para S. aureus (ATCC 25923) y E. coli (ATCC 25922) en la oscuridad y después de 2 h de exposición a la luz LED.

Gráficos de columnas que representan los valores MIC y MBC de nanocompuestos (A, B y G) para S. aureus (ATCC 25923) y E. coli (ATCC 25922) en la oscuridad y después de 2 h de exposición a la luz LED.

El ajuste se hizo a un estándar de turbidez de 0,5 McFarland diluido de Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Para el procedimiento de recuento de colonias, se añadieron 0,1 ml de DMSO al medio de cultivo Mueller Hinton Broth. La solución de opacidad adquirida se dividió luego en dos porciones para cada bacteria y se colocó en dos matraces diferentes. Se añadió nanocompuesto (0,01 g) a una de las soluciones bajo iluminación LED y el matraz restante se oscureció. Luego, los resultados obtenidos para S. aureus y E. coli en condiciones de oscuridad y luz se evaluaron completamente en las Tablas complementarias S6, S7, S8 y S9, respectivamente. Las fotografías de UFC de E. coli y S. aureus en presencia y ausencia de nanocompuestos con luz LED y oscuridad después de 10, 30 y 120 min se muestran en las Figs complementarias. S5 y S6 respectivamente. De acuerdo con los resultados obtenidos de las pruebas de conteo viable en presencia de nanocompuestos A, B y G y el muy buen desempeño de los nanocompuestos A y B en exposición a lámparas LED que en modo oscuro en la bacteria E. coli y S. aureus, en ocasiones se pueden mencionar 10 min, 30 min y 2 h según los gráficos de columnas que se han representado en la Fig. 13.

Gráficos de columnas que representan los resultados de las pruebas de conteo viable para S. aureus (ATCC 25923) y E. coli (ATCC 25922) en la oscuridad y bajo luz LED después de 10, 30 y 120 min.

Se informó que el nanocompuesto G tiene un efecto antibacteriano ligeramente mejor en la oscuridad que en la luz, mientras que el rendimiento del nanocompuesto B fue fenomenal. El método de colonias también reveló la existencia de bacterias E. coli (ATCC 25922) y S. aureus (ATCC 25923) inactivadas (muertas) en presencia de estos nanocompuestos. Finalmente, se encontró que eran efectivos contra dos cepas de bacterias dañinas. Los porcentajes de reducción para S. aureus y E. coli expresaron la actividad antibacteriana de cada nanocompuesto en la oscuridad y bajo luz LED (Fig. 14).

Gráficos de columnas que representan el porcentaje de reducción de S. aureus y E. coli en la oscuridad y con luz LED en 10, 30 y 120 min.

La detección de las ROS intracelulares se realizó mediante el indicador general de estrés oxidativo CM-H2DCFDA. DCFDA (10 ml; Sigma, Life Technologies C6827) se agravó en las células y se incubó a 37 °C durante 25 min. La sonda fluorescente DCFDA reacciona con el H2O2 intracelular para generar una emisión de fluorescencia que puede indicarse mediante citometría de flujo. La medición de la producción de H2O2 intracelular en SACS, antes y después del cultivo, se realizó mediante citometría de flujo usando DCFDA. Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se centrifugaron a 2500 g durante 5 min. la emisión de fluorescencia verde se midió entre 500 y 530 nm usando una máquina de citometría de flujo.

La evaluación de ROS por citometría de flujo también se realizó en condiciones de oscuridad y luz LED. Las funciones múltiples de ROS en la replicación bacteriana a agentes antibacterianos han sido confirmadas por evidencia43. Aquí, los resultados de las mediciones de ROS intracelulares producidos en E. coli y S. aureus, después del tratamiento con ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC se han representado en las Figs. 15 y 16 respectivamente. Teniendo en cuenta que la mayor cantidad de fluorescencia indica un mayor nivel de producción de ROS. En el histograma obtenido del análisis de citometría de flujo, cuanto más se mantiene el lado derecho, se demuestra el aumento de la ROS. El valor MIF informado representa la intensidad del color en cada muestra. Para la bacteria E. coli, el ROS aumentó después del tratamiento con ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC tanto en condiciones de oscuridad como de luz, mientras que se produjo un mayor aumento en condiciones de luz. Para la bacteria S. aureus, después del tratamiento, se obtuvo un aumento en la producción de ROS en la oscuridad y la luz. Aunque la mejora bajo la luz fue mayor que la condición de oscuridad para la bacteria S. aureus también, sin embargo, el aumento excedente de ROS para la bacteria E. Coli se observó bajo la luz.

Histogramas para la producción de ROS de E. coli que demuestran una mayor fluorescencia después del tratamiento con ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC en condiciones de luz y oscuridad.

Histogramas para la producción de ROS de S. aureus que demuestran una mayor fluorescencia después del tratamiento con ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC en condiciones de luz y oscuridad.

Se utilizó citometría de flujo para investigar el mecanismo de la actividad antibacteriana del nanocompuesto en las bacterias E. coli y S. aureus. Se cree que ROS desempeña un papel clave en las propiedades antibacterianas de los nanomateriales, ya que puede dañar directamente la membrana celular, los fosfolípidos y/o las proteínas de la membrana. Entre las ROS biológicamente relevantes, el superóxido (O2.-) surge de los procesos de transferencia de electrones43. Los nanomateriales con capacidad de producir especies reactivas de oxígeno (ROS) podrían ser una herramienta útil en la lucha contra las bacterias44,45. La PDT se basa en la producción de 1O2 como el ROS citotóxico predominante para sus efectos letales. Reacciona con más de un objetivo dentro de una célula, incluidas las bases de ADN, las proteínas y el colesterol que se encuentran en las membranas celulares. La porfirina, como fotosensibilizador, podría hacer que los oxígenos circundantes produzcan especies reactivas de oxígeno (ROS) cuando se exponen a un amplio espectro de luz46,47. Las NP Ag y AgCl tienen sinergias antibacterianas en la producción de ROS48,49. Además, debido al bang gap visible de los nanocompuestos a base de porfirina, son compuestos favorables para producir superóxido bajo una luz LED. Según el artículo informado, el nanocompuesto sintetizado tiene actividades antibacterianas en E. coli y S. aureus, y la presencia de nanocompuestos y en presencia de luz se ha relacionado con la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las bacterias resultaron dañadas como resultado de la generación de ROS que dañó las membranas (Fig. 17).

Mecanismo antibacteriano propuesto de las NC ZnTPP/Ag/AgCl/Cu.

Se realizó la prueba MTT para medir la toxicidad de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC en células de fibroblastos de prepucio humano HFF-1. Se sembraron 1 × 104 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos durante 24 h. Se agregaron a la placa diferentes concentraciones (0,0.390625, 0.78125, 1.5625, 3.125, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL) de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC (ocho repeticiones). Se realizó la incubación en placa durante 48 h. Luego, se agregaron 100 μL de solución de MTT (a una concentración final de 0.05 mg/pozo). Posteriormente, se utilizaron 100 μl/pocillo de dimetilsulfóxido (DMSO) para solubilizar los cristales de formazán formados en las células. La absorción se leyó a 570 nm utilizando un lector de microplacas. La inhibición de las células HFF-1 después de 24 h de incubación con las concentraciones de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC dependió de las dosis. El valor de la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50) de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC fue de 13,1 μg/mL para las células HFF en 24 h (Fig. 18). Dado que el valor obtenido de IC50 para ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC en comparación con el MIC obtenido (9,7 μg/mL) es mayor, parece que este nanocompuesto se puede utilizar en algunos tratamientos rastreables.

La viabilidad de las células HFF-1, 24 h después del tratamiento con ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC.

En resumen, se sintetizaron nuevos nanocompuestos usando un método efectivo y ecológico aplicado para desarrollar y construir nanoestructuras útiles, nuevas, heterogéneas de ZnTPP modificadas con Ag Cu y Au en un corto período de tiempo. La estructura, la morfología y las capacidades antibacterianas del nanocompuesto se han evaluado utilizando una variedad de métodos analíticos. Las imágenes de Fe-SEM confirmaron la estructura octaédrica, así como la gran dispersión de las NP de Au, Cu y Ag en la superficie de las NP de ZnTPP. Estos nanocompuestos también tenían excelentes características antibacterianas en presencia de luz. Difusiones en disco de agar, MBC. Se utilizaron MIC, experimento de conteo de colonias y análisis de citometría de flujo ROS para examinar la propiedad antibacteriana de estos nanocompuestos contra E. coli y S. aureus. Todas las pruebas antibacterianas y la evaluación de ROS intracelular se examinaron en la oscuridad y también con luz LED. El nanocompuesto ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NCs funcionó mejor en presencia de luz con un valor MIC de menos de 9,5 µg/mL, mientras que la eficiencia de ZnTPP/Au/Ag/AgCl NCs de este nanocompuesto fue mejor en la oscuridad. Se investigó la citotoxicidad de ZnTPP/Ag/AgCl/Cu NC contra células HFF-1. Según los hallazgos, estos nanocompuestos podrían usarse con una eficiencia casi constante en la purificación de agua y aplicaciones industriales. Además, tiene el potencial de ser utilizado en biotecnología y terapéutica. El uso de estos nanocompuestos en aplicaciones curativas in vivo, como la terapia fotodinámica, es, por lo tanto, un enfoque prometedor.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Grupo Inorgánico, Departamento de Química, Universidad de Ciencia y Tecnología de Irán (IUST), Teherán, 16846-13114, Irán

Sajedeh Tehrani Nejad, Rahmatollah Rahimi y Mahboubeh Rabbani

Grupo Orgánico y Nano (ONG), Departamento de Química, Universidad de Ciencia y Tecnología de Irán (IUST), PO Box 16846-13114, Teherán, Irán

Sadegh Rostamnia

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ST escribió el texto principal del manuscrito y realizó las pruebas experimentales. MR hizo la recopilación de datos y revisó el manuscrito. RR y SR son supervisores y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Rahmatollah Rahimi o Sadegh Rostamnia.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Nejad, ST, Rahimi, R., Rabbani, M. et al. Fotosíntesis fácil de nuevos nanocompuestos derivados de porfirinas que contienen Ag, Ag/Au y Ag/Cu para estudios fotobactericidas. Informe científico 13, 8580 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34745-0

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Recibido: 08 diciembre 2022

Aceptado: 06 mayo 2023

Publicado: 26 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34745-0

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