Navoximod modula el VHS local

Dec 30, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 621 (2023) Citar este artículo

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La viroterapia oncolítica puede provocar la lisis tumoral y la inmunidad antitumoral sistémica, pero el potencial terapéutico en humanos es limitado debido a la alteración de la replicación del virus y la capacidad insuficiente para superar el microambiente tumoral inmunosupresor (TME). Para resolver los problemas anteriores, identificamos que el inhibidor de la indoleamina 2, 3-dioxigenasa 1 (IDO1) Navoximod promovió la replicación del virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) y la oncólisis mediada por el HSV-1 en las células tumorales, lo que lo convierte en una modalidad de combinación prometedora. con viroterapia basada en HSV-1. Por lo tanto, cargamos HSV-1 y Navoximod juntos en un hidrogel inyectable y biocompatible (V-Navo@gel) para la viroterapia del carcinoma hepatocelular (CHC). El hidrogel formó un reservorio de administración local para maximizar la replicación y distribución viral en el sitio del tumor con una inyección de dosis única. En particular, V-Navo@gel mejoró el tiempo de supervivencia sin enfermedad de los ratones portadores de HCC y los protege contra la recurrencia del tumor. Además, V-Navo@gel también mostró una eficacia terapéutica eficaz en el modelo de cáncer de hígado ortotópico de conejo. Mecánicamente, descubrimos además que nuestra estrategia de combinación reprogramó por completo el TME a través de la secuenciación de ARN de una sola célula. Todos estos resultados indicaron colectivamente que la combinación de Navoximod con HSV-1 podría impulsar la replicación viral y remodelar TME para la erradicación de tumores a través del reservorio de hidrogel.

En los últimos años, gracias al éxito de los inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI) y la terapia celular adoptiva, la inmunoterapia del cáncer (ITC) ha logrado un éxito notable en múltiples tipos de cáncer1. Como el quinto cáncer más común a nivel mundial, la inmunoterapia para el carcinoma hepatocelular (CHC) enfrenta grandes obstáculos de baja tasa de respuesta y resultados clínicos indeseables debido al complejo microambiente inmunológico con potentes efectos inmunosupresores2,3,4. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar otras estrategias de inmunoterapia para el CHC para superar estos obstáculos. La viroterapia oncolítica ha surgido como una terapia prometedora en muchos estudios preclínicos y clínicos desde la aprobación de T-VEC, un virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) genéticamente modificado, por parte de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) para el tratamiento del melanoma. en 20155,6. A diferencia del bloqueo del punto de control inmunitario, que se basa más en la modulación de la TME, los virus oncolíticos no solo afectan a la TME para inducir inmunidad antitumoral, sino que también permiten un ataque directo y la destrucción de las células cancerosas7. Sin embargo, la tasa de remisión duradera del 16 % en pacientes con melanoma tratados con T-VEC y los resultados clínicos indeseables en tumores sólidos plantean demandas urgentes para una mayor optimización de la viroterapia8,9. Los efectos terapéuticos limitados se deben principalmente a dos razones: el microambiente tumoral inmunosupresor y la inmunidad antiviral mediante la cual el sistema inmunitario elimina la infección viral10. Sin embargo, la activación de la inmunidad antitumoral y la supresión de la inmunidad antiviral compiten en el TME y requieren una modulación cuidadosa para mantener el equilibrio entre ellos para una viroterapia optimizada.

La indoleamina 2, 3-dioxigenasa 1 (IDO1) es una proteína inmunosupresora importante que se ha encontrado que está regulada al alza en múltiples tipos de tumores11,12. Al catalizar triptófano (Trp) a quinurenina (Kyn), IDO1 inhibe las actividades de las células T CD8+ y las células asesinas naturales (NK), mejora la activación de las células T reguladoras (Treg) y facilita el reclutamiento de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). )13,14. En consecuencia, los inhibidores de IDO1 se han probado en varios estudios preclínicos y clínicos y han demostrado ser una estrategia eficaz para la inmunoterapia15,16. En este estudio, encontramos que el tratamiento con HSV-1 podría conducir a una regulación positiva de la expresión de IDO1 en las células de CHC, que actuó además como un mecanismo de retroalimentación negativa del sistema inmunitario para limitar la replicación de HSV-1 en el tumor. Por lo tanto, la inhibición de IDO1 durante la viroterapia contra el HSV-1 podría desempeñar funciones duales al modular el TME inmunosupresor y mejorar la replicación viral en las células tumorales, lo que nos proporcionó la justificación para combinar el inhibidor de IDO1 Navoximod con la viroterapia oncolítica contra el HSV-1 para el tratamiento del CHC.

Para lograr una liberación local del fármaco y una distribución viral maximizada en el sitio del tumor, encapsulamos HSV-1 y Navoximod en hidrogeles de seda inyectables (denominados V-Navo@gel) (Fig. 1). Demostramos que los hidrogeles de seda formaron un reservorio de suministro local, en el que el HSV-1 mantuvo una capacidad y distribución citotóxicas satisfactorias en el sitio del tumor y, mientras tanto, atenuó los daños fuera del objetivo en los órganos periféricos. Nuestra estrategia dio como resultado respuestas terapéuticas completas de tumores subcutáneos de CHC, en comparación con solo respuestas parciales obtenidas con HSV-1 o HSV-1/mezcla de Navoximod sin carga en los hidrogeles. Además, utilizamos la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) para perfilar profundamente la infiltración de células inmunitarias en el sitio del tumor, y revelamos que V-Navo@gel podría contrarrestar la TME inmunosupresora al remodelar las poblaciones de células inmunitarias dominadas por la acumulación de efector T células y células NK. El resultado beneficioso podría expandirse aún más al modelo de tumor hepático VX-2 implantado ortotópicamente en el conejo. En conjunto, demostramos que la combinación de Navoximod con HSV-1 aumentó la eficacia de la viroterapia oncolítica a través del reservorio de hidrogel, proporcionando evidencia para emplear esta estrategia para la investigación clínica.

Después de la inyección intratumoral, los hidrogeles podrían limitar el HSV-1 en el sitio del tumor para reducir la toxicidad sistémica. HSV-1 en el sitio del tumor podría inducir la expresión de la proteína inmunosupresora IDO1, lo que perjudicó el efecto terapéutico. Por lo tanto, la liberación de navoximod de V-Navo@gel podría inhibir la actividad enzimática de IDO1 y, posteriormente, mejorar la replicación del virus y las respuestas inmunitarias antitumorales al mismo tiempo.

Dado que la eliminación de HSV-1 por la inmunidad antiviral es uno de los principales obstáculos para la viroterapia basada en HSV-1, exploramos los genes que inhiben la replicación de HSV-1 entre los genes estimulados por interferón (ISG), que son los principales participantes de inmunidad antiviral, para la optimización de la viroterapia basada en HSV-1. Encontramos que la sobreexpresión de IDO1, uno de los ISG17 informados, inhibía la replicación de HSV-1 representada por los niveles de glicoproteína de envoltura gD (Fig. 2a) y ADN genómico de HSV-1 (que estaba indicado por gD y ADN de ICP47, Fig. 2b ). Se obtuvieron resultados consistentes en la línea celular de HCC humana SMMC-7721 y la línea celular de cáncer de mama de ratón 4T1 que la sobreexpresión de IDO1 inhibía la replicación de HSV-1, lo que sugiere la universalidad de nuestros hallazgos (Figura complementaria 1a, b). Además, utilizamos la señal de GFP generada a partir de HSV-1 etiquetado con GFP como otro índice de replicación de HSV-1, y se observó que la intensidad de GFP en las células que sobreexpresan IDO1 era mucho más baja que en las células de tipo salvaje después de la infección por HSV-1 ( Figura 2c). Se ha informado que IDO1 está sobreexpresado en múltiples tipos de cánceres15, y también confirmamos que está regulado al alza en tejidos tumorales de HCC de acuerdo con el conjunto de datos de RNA-Seq del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y los resultados de RNA-seq de nuestro grupo (Fig. .2d). En particular, la qPCR y la transferencia Western también revelaron que el tratamiento con HSV-1 podría inducir la regulación positiva de la expresión de IDO1 en las células Hepa1-6 tanto a nivel transcripcional como traduccional (Fig. 2e y Fig. 1c complementaria). Por lo tanto, IDO1 se sobreexpresó en tejidos de HCC y podría aumentar aún más mediante el tratamiento con HSV-1, que actuó como un mecanismo de retroalimentación negativa del sistema inmunitario para limitar la replicación de HSV-1 en las células tumorales. Junto con los informes anteriores de que IDO1 es inmunosupresor contra la inmunidad antitumoral, creíamos que era necesario bloquear IDO1 durante la viroterapia basada en HSV-1.

a-c Las células Hepa1-6 transfectadas con un vector vacío (VT) o una construcción IDO1 etiquetada con Flag se infectaron con HSV-1 durante 24 h. un análisis de transferencia Western de gD, FLAG y GAPDH. b Análisis RT-qPCR del nivel de ADN de gD (izquierda) e ICP47 (derecha) (n = 3; los datos se mostraron como medias ± SEM). c Imágenes de fluorescencia representativas (izquierda) y análisis de citometría de flujo (derecha) de células Hepa1-6 positivas para GFP. Barra de escala: 100 μm. n = 3. Los datos se mostraron como medias ± SEM. d La expresión de IDO1 en HCC y sus tejidos peritumorales correspondientes se determinó mediante la cohorte TCGA HCC (izquierda) y la secuenciación del transcriptoma (derecha). Los datos se mostraron como medias ± SEM. e Las células Hepa1-6 infectadas con 20 MOI HSV-1 durante 12 h se analizaron mediante RT-qPCR para el nivel de ARNm de IDO1 (n = 3; los datos se mostraron como medias ± SEM). f, g Las células Hepa1-6 se trataron con 5 MOI HSV-1 o 5 MOI HSV-1 más Navoximod 1 µM (V-Navo). f Análisis RT-qPCR del nivel de ADN de gD (izquierda) e ICP47 (derecha) en los puntos de tiempo indicados (n = 3; los datos se mostraron como medias ± SEM). g Análisis de transferencia Western de gD y GAPDH. h La viabilidad celular de las células Hepa1-6 con los tratamientos indicados se determinó mediante análisis de citometría de flujo utilizando anexina V-APC y tinción con PI (n = 2; los datos se mostraron como medias ± SEM). i Análisis RT-qPCR de los niveles intratumorales de ADN genómico del HSV-1 representados por gD (izquierda) e ICP47 (derecha) 8 días después de los tratamientos indicados (n = 7; los datos se muestran como medias ± SEM).

Navoximod es un inhibidor de IDO1 altamente selectivo. Con base en los hallazgos anteriores de que IDO1 podría limitar la replicación de HSV-1, luego investigamos si el Navoximod dirigido a IDO1 podría revertir la inhibición de la replicación de HSV-1 y los efectos citotóxicos. En comparación con el tratamiento de HSV-1 solo, la mezcla de HSV-1/Navoximod (denominada V-Navo) indujo una mejora espectacular del nivel de ADN genómico y el nivel de proteína gD de HSV-1, lo que indica que Navoximod mejoró la replicación de HSV-1 ( Fig. 2f, g). De manera consistente, validamos aún más que Navoximod mejoró la replicación de HSV-1 en células SMMC-7721 y 4T1 (Figura complementaria 1d, e). También evaluamos el efecto de dos inhibidores de IDO1 adicionales, Indoximod y Epacadostat, en la replicación de HSV-1, y los resultados indicaron que ambos compuestos fueron capaces de mejorar la replicación de HSV-1 en células Hepa1-6 (Fig. 1f complementaria). Además, la mezcla de HSV-1/Navoximod disminuyó la viabilidad celular de las células Hepa1-6, lo que indica que Navoximod mejoró la oncólisis mediada por HSV-1 de las células de HCC (Fig. 2h). Además, el modelo subcutáneo de HCC y ratones 4T1 indicó que la inyección intratumoral de Navoximod aumentó la replicación de HSV-1 en el sitio del tumor (Fig. 2i y Fig. 1g complementaria). En conjunto, estos datos demostraron que Navoximod podría fortalecer la replicación y los efectos oncolíticos de HSV-1 tanto in vitro como in vivo, lo que sugiere el potencial y la ventaja de la viroterapia combinatoria de HSV-1 y Navoximod.

Para maximizar la distribución viral a las células tumorales, introdujimos hidrogeles de seda generados a partir de capullos como sistema de administración intratumoral para el virus (Fig. 3a)18. La citotoxicidad limitada y la excelente bioseguridad de los hidrogeles de seda se demostraron por primera vez en células Hepa1-6 (Fig. 2a complementaria). A continuación, encapsulamos el HSV-1 en hidrogeles de seda (Virus@gel) y verificamos sus características biológicas. Virus@gel mostró propiedades inyectables y gelatinosas (Fig. 3b), que son características importantes para un sistema de administración de hidrogel factible. La estructura de red porosa de Virus @ gel y la distribución de viriones dentro de los hidrogeles se verificaron mediante microscopía electrónica de barrido y microscopía confocal, respectivamente (Fig. 3c, d y Fig. 2b complementaria). La evaluación adicional de las propiedades reológicas y de hinchamiento demostró el estado de gel de Virus@gel y la baja relación de hinchamiento (Fig. 2c, d complementarias), lo que indicó buenas propiedades mecánicas y estabilidad del material.

a La imagen del proceso de solución a gel de los geles de seda. b La imagen del HSV-1 encapsulado en los hidrogeles de seda (Virus@gel) demostró las características de gelificación e inyectabilidad. c Imagen SEM de Virus@gel. d Imagen confocal 3D de HSV-1 marcado con DyLight 550 dentro de hidrogeles de seda. e, f El análisis de citometría de flujo (e) y las imágenes de fluorescencia representativas (f) de células Hepa1-6 positivas para GFP en el experimento de liberación sostenida. Barra de escala: 100 μm. n = 3. Los datos se mostraron como medias ± SEM. g La viabilidad celular después del tratamiento con PBS, PBS@gel, HSV-1 o Virus@gel se determinó mediante análisis de citometría de flujo utilizando anexina V-APC y tinción con PI (n = 3; los datos se muestran como medias ± SEM). h–j Se inyectó intratumoralmente HSV-1 o Virus@gel a ratones con tumores Hepa1-6. h La acumulación de HSV-1 marcado con DyLight 550 en el sitio del tumor en los puntos de tiempo definidos. Los círculos rojos indicaron los sitios del tumor. Las flechas rojas indicaron la difusión del virus fuera de los tumores. i La imagen de fluorescencia representativa de las secciones de tumor congeladas 8 días después de la administración intratumoral de HSV-1 o Virus@gel. Las señales de GFP indicaron células infectadas por HSV-1. Barra de escala: 100 μm. j Análisis RT-qPCR de los niveles intratumorales de ADN genómico de HSV-1 representados por gD en los puntos de tiempo definidos (n = 8; los datos se mostraron como medias ± SEM).

Además, demostramos que los hidrogeles de seda permitieron apoyar la liberación sostenida de los viriones durante 7 días (Fig. 3e, f, ver la Fig. 2d complementaria). El ensayo de viabilidad celular demostró que Virus@gel causó el 76,6 % de la muerte celular después de cocultivar con células Hepa1-6 durante 4 días, lo que sugiere un excelente efecto oncolítico de Virus@gel (Fig. 3g). Además, el experimento con animales in vivo mostró que el HSV-1 cargado en los hidrogeles de seda podía detectarse 3 días después de la inyección, mientras que la señal del HSV-1 libre se debilitaba rápidamente en el sitio del tumor en 3 h, lo que confirma que los hidrogeles de seda se extienden. la retención localizada de los viriones en el sitio del tumor (Fig. 3h). De manera consistente, Virus@gel mejoró la señal de GFP de HSV-1 y el nivel de ADN genómico de HSV-1 en el sitio del tumor en comparación con el tratamiento de HSV-1 solo (Fig. 3I, j). Los datos anteriores demostraron que nuestros hidrogeles de seda permitieron mejorar la retención localizada y la replicación del virus en el sitio del tumor.

Además, demostramos que los hidrogeles de seda impidieron la difusión del virus y la infección en los tejidos sanos, lo que se indicó por el nivel de ADN genómico del HSV-1 dentro del sistema neural, la sangre y los órganos periféricos después de la inyección subcutánea de HSV-1 o Virus@gel (Suplementario Fig. 3a, b). La bioquímica sanguínea y los índices de rutina de los ratones indicaron la toxicidad limitada de Virus@gel (Fig. 3c complementaria). Las imágenes H&E de los órganos principales mostraron consistentemente un daño insignificante entre todos los grupos (Fig. 3d complementaria).

En conjunto, estos resultados indicaron que Virus@gel, que mostró baja toxicidad sistémica y buena bioseguridad, podría maximizar drásticamente la distribución y replicación del virus en el sitio del tumor, lo que lo convierte en una plataforma de administración potencial para la viroterapia.

En función de los hallazgos anteriores, exploramos a continuación los efectos antitumorales de V-Navo@gel (mezcla de HSV-1/Navoximod encapsulada dentro de hidrogeles de seda) en el modelo de ratón con HCC subcutáneo. Se inocularon ratones C57BL/6 por vía subcutánea con células Hepa1-6 y se trataron con una dosis única de PBS, HSV-1, hidrogeles cargados con HSV-1 (Virus@gel), hidrogeles cargados con Navoximod (Navo@gel), HSV-1 más mezcla de Navoximod (V-Navo) o V-Navo@gel, respectivamente (Fig. 4a). Entre todos los grupos, los ratones tratados con V-Navo@gel mostraron los efectos inhibidores más fuertes sobre los tumores, lo que se indicó por el cambio en el volumen del tumor (Fig. 4b–d) y la tasa de supervivencia (Fig. 4e). Los tumores en dos de los seis ratones tratados con V-Navo@gel se erradicaron por completo y todos los ratones de este grupo sobrevivieron 40 días después de la inoculación del tumor sin una fluctuación obvia del peso corporal (Fig. 4d-f). Se obtuvieron resultados consistentes en el modelo de tumor 4T1, en el que el tratamiento con V-Navo@gel resultó en los efectos inhibitorios más fuertes sobre el crecimiento de los tumores sin fluctuaciones obvias del peso corporal (Fig. 4 complementaria). La tinción con H&E, Ki67 y TUNEL de la sección del tumor indicó que V-Navo@gel causó los daños citolíticos más graves en los tejidos tumorales entre todos los grupos (Fig. 5 complementaria). Estos hallazgos confirmaron que V-Navo@gel podría prevenir eficazmente el crecimiento del tumor CHC e inducir la oncólisis de las células tumorales.

un esquema del procedimiento terapéutico. b, c Volúmenes tumorales de ratones con tratamientos indicados. El número entre paréntesis indica la tasa de respuesta objetiva del tumor (ORR) de los ratones en cada grupo después de todo el proceso de monitoreo (n = 6 ratones por grupo; los datos se muestran como medias ± SEM). d Imágenes tumorales aisladas de ratones después de los tratamientos indicados. e Las curvas de supervivencia de los ratones con los tratamientos indicados (n = 6; los datos se muestran como medias ± SEM). f Cambios en el peso de los ratones inoculados durante toda la medición (n = 6; los datos se mostraron como medias ± SEM). g Esquema del modelo de reexposición al tumor. h, i Volúmenes tumorales de ratones con los tratamientos indicados (n = 8; los datos se mostraron como medias ± SEM). j Imágenes tumorales aisladas de ratones después de los tratamientos indicados. k Gráficos de FACS representativos (controlados en células CD4+ o CD8+) y el porcentaje de Tem (CD62LlowCD44high), Tcm (CD62LhighCD44high) y células T vírgenes (CD62LhighCD44low) fueron examinados por FACS (n = 3; los datos se mostraron como medias ± SEM) .

A continuación, se realizó un estudio de reexposición al tumor para determinar si V-Navo@gel podría proteger a los ratones curados con HCC de la recurrencia del tumor (Fig. 4g). Durante el período de observación de 22 días, todos los ratones con tumores expuestos nuevamente a células Hepa1-6 en el grupo V-Navo@gel permanecieron libres de tumores (Fig. 4h-j). Para descifrar aún más los mecanismos subyacentes de la protección contra la recurrencia del tumor, analizamos la abundancia de células T vírgenes (CD62LhighCD44low), TCM (CD62LhighCD44high) y TEM (CD62LlowCD44high) de células T CD4+ y CD8+ en el bazo de los ratones después de re- experimentos de desafío. En comparación con el grupo de control, V-Navo@gel provocó una disminución de las células T vírgenes y la MTC, mientras que aumentó la TEM de las células T CD4+ y CD8+, lo que sugiere que V-Navo@gel indujo una conversión de las células de memoria vírgenes y centrales. Células T para efector células T de memoria para la rápida erradicación de la recurrencia del tumor (Fig. 4k).

Para realizar un análisis más detallado e imparcial de la población inmunitaria y la interacción tumor-inmune en los tumores de los ratones tratados con V-Navo@gel, se inyectó intratumoralmente PBS, Virus@gel o V-Navo@gel y los tumores se disociaron por separado. -secuenciación de ARN celular (scRNA-seq) cuando hubo una regresión tumoral sustancial pero no una erradicación completa. Primero utilizamos un análisis de datos de agrupamiento no supervisado para separar las células totales en distintos grupos y se identificaron poblaciones de células tumorales, células derivadas de mieloides, células T, células NK, fibroblastos, células murales y fibroblastos con firmas moleculares distintas (Fig. 6a complementaria, b). Entre las células inmunitarias infiltrantes de tumores, las células derivadas de mieloides y las células T/NK son las poblaciones celulares predominantes (Fig. 6c complementaria), que se clasificaron adicionalmente en función de los marcadores canónicos para cada población19,20,21.

Luego llevamos a cabo un agrupamiento no supervisado de células T/NK de scRNA-seq en grupos de control, Virus@gel y V-Navo@gel. Surgieron un total de ocho grupos, incluidos cuatro grupos de células T CD8+, tres grupos de células T CD4+ y un grupo de células NK, cada uno con sus genes característicos únicos (Fig. 5a, b). La comparación de estos grupos entre los tratamientos con PBS, Virus@gel y V-Navo@gel se presentó en las Fig. 5c, d. Cabe destacar que la población de células NK (grupo T_6) se enriqueció después del tratamiento con V-Navo@gel. V-Navo@gel también indujo un gran enriquecimiento de CTL CD8+ citotóxicos (grupo T_3, con sobreexpresión de marcadores citotóxicos Gzmf/d/e y marcadores efectores Ifng/Nkg7) y CTL CD8+ cíclicos (grupo T_1 y T_2, con sobreexpresión de ciclo celular y marcadores de replicación de ADN Cenpf/e, Top2a, Mki67, Npm1 y Rrm2). El espectacular aumento de los subconjuntos de células NK y células T CD8+ con firmas de expresión génica funcional citotóxica y proliferante explicó la prometedora eficacia de erradicación de tumores mediante el tratamiento con V-Navo@gel en el modelo de ratón con CHC subcutáneo. Mientras tanto, las células T auxiliares (grupo T_8), que son fundamentales para las respuestas inmunitarias antitumorales al activar las células T efectoras y reclutar células inmunitarias innatas como los macrófagos, también se enriquecieron después del tratamiento con V-Navo@gel.

un gráfico UMAP que muestra grupos de células identificados dentro de la población T/NK. b Mapa de calor de burbujas que muestra la expresión de genes característicos seleccionados en cada grupo T/NK. El tamaño de la burbuja representa el porcentaje de células que expresan, coloreadas según los niveles de expresión normalizados. c Comparación de grupos de células T/NK entre los tratamientos con PBS, Virus@gel y V-Navo@gel. d Cuantificación de la proporción de cada población de tipo celular según el tratamiento. e Gráfico UMAP que muestra grupos de células identificados dentro de la población derivada de mieloide. f Mapa de calor de burbujas que muestra la expresión de genes distintivos seleccionados en cada grupo derivado de mieloide. El tamaño de la burbuja representa el porcentaje de células que expresan, coloreadas según los niveles de expresión normalizados. g Comparación de grupos de células derivadas de mieloides entre los tratamientos con PBS, Virus@gel y V-Navo@gel.

Se ha establecido que las poblaciones mieloides en TME exhiben impactos potentes en la inmunidad de las células T22,23, por lo que también nos enfocamos en la variación de las poblaciones mieloides después de la viroterapia con V-Navo@gel. El agrupamiento no supervisado de células derivadas de mieloides mostró un total de once grupos, incluidos siete para macrófagos, uno para monocitos y tres para DC (Fig. 5e, f). En particular, la población de cDC1 (grupo MD_10), que se ha informado que estimula las células T CD4+ y CD8+ y mejora directamente la inmunidad antitumoral mediada por células T24, se enriqueció con el tratamiento con V-Navo@gel en comparación con el grupo PBS y tratamiento único Virus@gel (Fig. 5g). Además, también observamos cambios en las poblaciones de macrófagos (Fig. 5g). Hace tiempo que se establecieron dos fenotipos funcionales de macrófagos M1 y M2 en los que los macrófagos M1 se consideran antitumorales mientras que los macrófagos M2 contribuyen a los resultados protumorales. V-Navo@gel provocó un enriquecimiento del grupo de macrófagos MD_3 con una fuerte expresión de los genes distintivos M1, lo que sugirió que los macrófagos M1 también participaron en el proceso antitumoral mediado por V-Navo@gel (Fig. 5g y Fig. 6d complementaria) . Los resultados anteriores indicaron colectivamente que la viroterapia V-Navo@gel elevó las poblaciones mieloides de macrófagos cDC1 y M1 y, por lo tanto, beneficia la eficacia antitumoral.

Para evaluar más a fondo el impacto del V-Navo@gel en las actividades biológicas de las células cancerosas, realizamos un análisis GO de los genes expresados ​​de manera diferente en las células cancerosas. El análisis GO descubrió un enriquecimiento del proceso de quimiotaxis celular mediante el tratamiento con V-Navo@gel, con una regulación positiva de las subfamilias CCL y CXCL que previamente se reconocía que modulaban el reclutamiento, la diferenciación y la expansión de las células inmunitarias (Fig. 6a, b y Fig. 7 complementaria) . Para investigar la relación entre la regulación positiva de los genes de la familia CCL/CXCL y la inmunidad antitumoral derivada de las células T, se realizó CellphoneDB para analizar la comunicación entre las células cancerosas y las células T. El análisis del ligando-receptor reveló que CCL2/CCR2, CXCL10/CXCR3 y CXCL11/CXCR3 fueron los principales módulos de interacción para mediar la diafonía entre las células cancerosas y las diferentes poblaciones de células T (Fig. 6c), y las interacciones mejoradas de estos pares de ligando-receptor entre las células cancerosas y las células T (Fig. 6d). Por lo tanto, los datos anteriores sugirieron que además de influir en las poblaciones de células inmunitarias, el tratamiento con V-Navo@gel también impactó en las células cancerosas para modular el reclutamiento de células T en los sitios del tumor.

a, b Los 10 términos principales en el análisis de ontología génica (GO) de genes expresados ​​de forma diferente en el grupo V-Navo@gel frente a PBS (a) y el grupo V-Navo@gel frente a Virus@gel (b). c Descripción general de las interacciones ligando-receptor entre las células cancerosas y diferentes grupos de células T. El tamaño de la burbuja representa el valor p. El color representa la media del nivel de expresión promedio de las interacciones. d Interacciones ligando-receptor seleccionadas entre células cancerosas y diferentes grupos de células T en los grupos de PBS, Virus@gel y V-Navo@gel. El tamaño de la burbuja representa el valor p. El color representa la media del nivel de expresión promedio de las interacciones.

A continuación, realizamos un análisis de citometría de flujo y una tinción IHC para confirmar los cambios sistémicos del microambiente inmune tumoral que observamos en scRNA-seq (Fig. 7a). El nivel de maduración de las CD (CD11c+/CD80+/CD86+) en los ganglios linfáticos que drenan el tumor se analizó primero mediante citometría de flujo. Cabe destacar que V-Navo@gel desencadenó el nivel más alto de maduración de DC entre todos los grupos (Fig. 7b). La tinción con NK1.1 de las secciones tumorales demostró el aumento de la infiltración intratumoral de células NK después del tratamiento con V-Navo@gel, lo cual es consistente con el análisis de scRNA-seq (Fig. 8a complementaria). Las células T efectoras CD8+ en tejidos tumorales también se analizaron mediante citometría de flujo e inmunotinción, ya que se observaron cambios drásticos en la población de células T CD8+ en el análisis de scRNA-seq después del tratamiento con V-Navo@gel. De manera consistente, tanto FACS como la inmunotinción indicaron que V-Navo@gel promovió efectivamente la infiltración de células T CD8+ en el sitio del tumor (Fig. 7c, d). Además, V-Navo@gel inhibió fuertemente la infiltración intratumoral de Tregs en comparación con el grupo PBS (Fig. 7e). Un análisis adicional de los lisados ​​​​del tumor indicó que V-Navo@gel podría elevar las citoquinas proinflamatorias (IL12 e IFNγ) y la granzima B, el marcador de las células T activadas, en el sitio del tumor (Fig. 7f), lo que indica el aumento de anti- Respuestas inmunitarias tumorales contra tumores. Además, realizamos un ensayo ELISPOT de IFNγ ex vivo utilizando células T esplénicas para validar la generación de células T específicas del tumor. Nuestro ensayo ELISPOT mostró que V-Navo@gel activó de manera sólida las células T CD8+ específicas de antígeno generadas contra las células Hepa1-6, lo que indica la generación exitosa de linfocitos T citotóxicos específicos de tumor. Sin embargo, no pudimos observar la activación de las células T CD4+ específicas del tumor que funcionan principalmente en la coordinación de la respuesta inmune y requieren una activación fuerte y sostenida para producir IFNγ (Fig. 8b complementaria). El análisis de RT-PCR también mostró que, en comparación con PBS o Virus@gel, V-Navo@gel indujo una regulación positiva de CCL2, CXCL10 y CXCL11 (Fig. 8c complementaria). Este resultado apoyó el análisis GO y el análisis CellphoneDB en la Fig. 6, lo que sugiere que nuestro V-Navo@gel regula al alza los genes de la familia CCL/CXCL para un reclutamiento de células T más eficiente. En general, estos hallazgos sugirieron que V-Navo@gel reprogramó integralmente el microambiente inmunitario del tumor para lograr una viroterapia eficaz contra el CHC.

Esquema de análisis de la respuesta inmune durante el procedimiento terapéutico. b Gráficas FACS representativas (controladas en células DC CD11c+) y el porcentaje de maduración de DC inducida en ganglios linfáticos que drenan tumores en ratones portadores de tumores con los tratamientos indicados (n = 6; los datos se muestran como medias ± SEM). c Gráficos de FACS representativos (controlados en células CD3+) y el porcentaje de linfocitos T CD8+ fueron examinados por FACS (n = 6; los datos se mostraron como medias ± SEM). d Imágenes representativas de la tinción de CD4 (rojo), CD8 (verde) y DAPI (azul) de secciones tumorales después de los tratamientos indicados. Barra de escala (fila superior): 200 μm. Barra de escala (fila inferior): 100 μm. e Las gráficas FACS representativas (controladas en células CD4+) y el porcentaje de células Tregs fueron examinadas por FACS (n = 6; los datos se mostraron como medias ± SEM). f Niveles de citocinas en lisados ​​tumorales mediante análisis ELISA después de los tratamientos indicados (n = 6; los datos se muestran como medias ± SEM).

Para ampliar aún más el potencial de aplicación clínica, examinamos la capacidad antitumoral de V-Navo@gel en conejos blancos de Nueva Zelanda con carcinoma inducido por células tumorales VX-2 implantadas en el hígado como modelo animal grande (Fig. 8a). Primero demostramos que HSV-1 podría infectar y matar con éxito las células tumorales VX-2 in vitro (Fig. 9a complementaria). Además, validamos la asociación entre IDO1 y HSV-1 en células tumorales VX-2. Como se muestra en las figuras complementarias 9b y c, la sobreexpresión de IDO1 inhibió fuertemente la replicación de HSV-1 en células VX2, como lo indican los niveles reducidos de ADN genómico y la proteína gD. De manera consistente, Navoximod mejoró la replicación de HSV-1 en células VX-2, como lo indican los niveles aumentados de ADN genómico y proteína gD (Figura complementaria 9d, e). Estos hallazgos confirmaron la asociación entre IDO y HSV-1 en células VX-2 y respaldan los estudios in vivo adicionales en el modelo de cáncer de conejo VX-2. Para los estudios in vivo, se trituraron tejidos tumorales VX-2 y se implantaron en el lóbulo izquierdo expuesto del hígado de conejo (Fig. 8b). Después de 12 días, cuando el volumen promedio de los tumores se convirtió en 200 mm3, los conejos se aleatorizaron en grupos tratados con PBS, V-Navo y V-Navo@gel, y los agentes terapéuticos se inyectaron en el sitio del tumor bajo la guía de imágenes por ultrasonido (Fig. 8c). La figura 8d muestra las imágenes de ultrasonido durante la intervención. El peso de los animales se controló cada cuatro días, y cuando la pérdida de peso corporal de un grupo superó el 20%, los tres grupos se sacrificaron y los hígados se aislaron para evaluar el tamaño y la ubicación del tumor. Un conejo en el grupo tratado con PBS murió el día 21. Como se muestra en la Fig. 8e, los animales en el grupo tratado con PBS exhibieron la pérdida de peso corporal más obvia (más del 20 %), mientras que el peso corporal de los animales en V-Navo y V -Los grupos tratados con navo@gel permanecieron casi sin cambios. En la necropsia, los conejos tratados con V-Navo@gel mostraron los efectos inhibidores más fuertes sobre los tumores en comparación con los grupos de PBS y V-Navo (Fig. 8f, g). En conjunto, estos resultados indicaron que V-Navo@gel mostró un fuerte efecto antitumoral en el modelo de cáncer de hígado VX-2 de conejo.

un esquema del procedimiento terapéutico. b El procedimiento de implantación de tejidos tumorales VX-2 en el lóbulo izquierdo expuesto del hígado de conejo. c El procedimiento de inyección bajo la guía de ultrasonido. d Las imágenes de ultrasonido durante la intervención. e Cambios de peso de los conejos inoculados durante toda la medición (n = 5; los datos se muestran como medias ± SEM). f El número de nódulos metastásicos en los hígados de conejos con los tratamientos indicados (n = 4 en el grupo tratado con PBS, n = 5 en el grupo tratado con V-Navo o V-Navo@gel; los datos se muestran como medias ± SEM). g Imágenes de hígados aislados de conejos con los tratamientos indicados.

La viroterapia oncolítica ha mostrado un gran potencial en la inmunoterapia del cáncer. Sin embargo, aún existen desafíos importantes, incluida la escasa capacidad de las células efectoras inmunitarias para infiltrarse y funcionar en el entorno inmunitario del tumor "frío", así como las estrategias antivirales desarrolladas por el huésped para limitar la propagación viral. Para encontrar las soluciones, se han informado varios enfoques que incluyen la incorporación de genes exógenos en los genomas virales y la combinación con inhibidores de puntos de control inmunitarios o con transferencia adoptiva de células efectoras inmunitarias25,26. Nuestro estudio demostró que podíamos superar ambos obstáculos mediante la combinación del inhibidor de HSV-1 y IDO1 Navoximod. Durante mucho tiempo se ha reconocido que IDO1 desempeñaba funciones opuestas en la infección por patógenos al suprimir la replicación de patógenos directamente27 o al inhibir la actividad de las células T28. Recientemente, la acumulación de estudios informó el papel moderador inmunológico de IDO1 en TME; provoca anergia de las células T efectoras y las células NK al inducir el agotamiento de Trp y promueve la diferenciación de Treg por la acumulación de Kyn, lo que finalmente conduce a la evasión inmune del tumor29,30,31. En nuestro estudio, demostramos que el tratamiento con HSV-1 en células de CHC regulaba al alza la expresión de IDO1, y que IDO1 alteraba la replicación de HSV-1 en células de CHC como un ciclo negativo del sistema inmunitario para eliminar los virus, lo que aumentaba la demanda de inhibición de IDO1 durante la fase de HSV-1. Viroterapia basada en 1. Los hallazgos anteriores nos proporcionaron el fundamento para una terapia combinada de HSV-1 e inhibidor de IDO1. Otro estudio también combinó un adenovirus oncolítico que lleva un activador de células T con el inhibidor IDO1 para el tratamiento de tumores cerebrales y logró un resultado terapéutico prometedor mediante la remodelación de las respuestas inmunitarias antitumorales32. Por lo tanto, realizamos experimentos para seleccionar los mejores inhibidores de IDO1 para inducir la replicación de HSV-1 y descubrimos que Navoximod tenía el efecto más fuerte en comparación con Indoximod o Epacadostat en cada EC50 (Fig. 2f y Fig. 1g complementaria). Además, el hecho de que Navoximod ya se haya utilizado con éxito en nuestro grupo para la terapia del cáncer también aumentó la confianza en nuestra decisión de elegir Navoximod sobre otros inhibidores de IDO-1 para la viroterapia combinatoria HSV-133. De hecho, los modelos animales ilustraron que el hidrogel biocompatible encapsulado con HSV-1 y Navoximod mostró un gran potencial terapéutico tanto para el CHC primario como para la recurrencia del tumor.

La mayoría de los ensayos clínicos de viroterapia oncolítica adoptan dosis repetidas para maximizar la distribución viral en el sitio del tumor, lo que dificulta cuando se requiere una inyección intratumoral. Aquí propusimos una estrategia de entrega local para incrustar los virus en hidrogeles de seda. Silk-hydrogels es un biomaterial novedoso con amplias aplicaciones debido a su excelente biocompatibilidad y se ha utilizado en el campo de la ingeniería de tejidos y la administración de fármacos34. En este estudio, los hidrogeles actuaron como depósito para la liberación sostenida de los viriones concentrados en los tejidos tumorales después de una inyección de dosis única. La acumulación de estudios ha informado que diferentes tipos de hidrogeles, incluido el hidrogel similar a la elastina de seda, el hidrogel de gelatina, y otros, se han utilizado para encapsular adenovirus para la viroterapia antitumoral35,36,37. Demostramos que los hidrogeles de seda in situ que propusimos aquí podrían confinar el HSV-1 en el sitio del tumor, lo que indujo aún más la replicación del virus intratumoral y limitó la infección de órganos periféricos. En general, este sistema de hidrogel podría lograr una liberación y un enriquecimiento sostenibles de los viriones en el sitio del tumor, lo que lo haría aplicable a otros virus oncolíticos como plataforma de administración universal para la viroterapia.

El análisis de la secuenciación del ARN de una sola célula arrojó luz sobre las poblaciones inmunitarias predominantes en los tumores tratados con V-Navo@gel. Estudios previos han indicado el potencial potenciador del oncolítico HSV-1 para activar las células T CD8+38. La secuenciación de scRNA junto con el siguiente FACS y el ensayo de inmunofluorescencia indicaron que V-Navo@gel generó fuertes respuestas de células T CD8+, lo que explica los admirables efectos terapéuticos contra los tumores. Como células efectoras antitumorales dominantes, las células NK también se enriquecieron después del tratamiento con V-Navo@gel. También encontramos un aumento en la población de células T de memoria, lo que fue consistente con la protección de la recurrencia del tumor que observamos. De acuerdo con el análisis scRNA-seq y FACS, los subconjuntos de DC también se modularon después del tratamiento con V-Navo@gel. Se ha informado que cDC1 puede presentar antígenos directamente a las células T CD4+ y CD8+ y generar sinergia con la inmunidad de las células T para una eficacia antitumoral óptima24. Observamos que V-Navo@gel indujo el enriquecimiento de la población de cDC1, posiblemente debido a la replicación del virus regulada al alza y la oncolisis causada por la combinación de HSV-1 y Navoximod y, posteriormente, a una mayor liberación de antígenos tumorales.

Además de las poblaciones de células inmunitarias, scRNA-seq reveló además que nuestra terapia combinada también reprogramó las células cancerosas inmunosupresoras a través de la regulación positiva de las vías de quimiotaxis. El tratamiento con V-Navo@gel indujo la expresión de quimiocinas en células cancerosas, incluidas CCL2, CXCL10 y CXCL11, que impulsan la generación y el reclutamiento de células T, células B y células derivadas de mieloides39. Mientras que CCL2, CXCL10 y CXCL11 pueden reclutar células T directamente en los tumores, CCL2 también mejora el reclutamiento de macrófagos que posteriormente aumentan la infiltración de células T intratumorales40,41,42. De hecho, el análisis de interacción célula-célula reveló que después del tratamiento con V-Navo@gel hubo más comunicaciones entre las células cancerosas y diferentes grupos de células T a través de pares CCL2/CCR2, CXCL10/CXCR3 y CXCL11/CXCR3, lo que podría contribuir al aumento infiltración intratumoral de células T inducida por V-Navo@gel. En total, el análisis de scRNA-seq ayudó a revelar una reprogramación de los tumores inmunológicamente "fríos" a los "calientes" mediante el tratamiento con V-Navo@gel, lo que favorece la inmunidad antitumoral.

Colectivamente, demostramos que HSV-1 y Navoximod podrían administrarse como un tratamiento combinado a través de hidrogeles de seda para facilitar la eficacia terapéutica de HCC mediante la remodelación del microambiente tumoral inmunosupresor. Además, esta estrategia podría adaptarse a otras modalidades inmunoterapéuticas (incluidas las células adoptivas, los inhibidores del punto de control inmunitario, etc.) como reservorio localizado para la terapia contra el cáncer.

Las células Hepa1-6 y HEK293T se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células VX2, SMMC7721 y 4T1 se obtuvieron de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células Vero fueron un regalo de Jiahuai Han en la Universidad de Xiamen. Todas las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) (ExCell, China). Todas las células se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2. Para la transfección transitoria de IDO1 en las líneas de células tumorales, se usó Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) siguiendo los protocolos del fabricante.

GFP-HSV-1, que se generó insertando la secuencia GFP en G47delta BAC, se usó en todos los entornos experimentales como virus oncolíticos y se propagó en células Vero43. Los títulos de virus amplificados se determinaron en células Vero utilizando el ensayo de placas virales como se describió previamente44. Para determinar los niveles de ADN genómico de HSV-1, se extrajo ADN genómico de HSV-1 de muestras de cultivo de tejidos o células infectadas con HSV-1 utilizando el kit de ADN genómico TIANamp (TIANGEN, Alemania). Luego se realizó qPCR para el análisis de ADN genómico de HSV-1 con los siguientes cebadores:

HSV-1 gD: 5'-acgactggacggagattaca-3' y 5'-ggagggcgtacttacaggag-3';

HSV-1 ICP47: 5'-ggtgtggcacatcgaaga-3' y 5'-aacgggttaccggattacg-3'.

La solución de fibrina de Bombyx mori se preparó de acuerdo con los trabajos anteriores y nuestros publicados con ligeras modificaciones18,45. Brevemente, los capullos (5 g) se cortaron en pedazos, se hirvieron durante 30 min en una solución de Na2CO3 (20 mM) y luego se enjuagaron tres veces en ddH2O para eliminar las proteínas de sericina. A continuación, la fibroína de seda extraída se secó al aire a 60 °C durante 12 h. Posteriormente, la fibroína de seda seca se disolvió en una solución de sal de LiBr 9,3 M a 60 °C durante 4 h y luego se dializó (Mw, 3,5 KDa) durante 72 h para eliminar la sal de LiBr. La solución de fibroína de seda obtenida se purificó por centrifugación a 4 °C y luego se restauró a 4 °C para su uso posterior. Para obtener hidrogeles de seda al 2 % en peso, los geles se prepararon desgomando soluciones de seda al 2 % en peso y sonicándolos con una sonda ultrasónica (Scientz-IID, Ningbo Scientz Biotechnology, China) al 30 % de amplitud durante 180 s. Luego, la solución resultante se envejeció a 37 °C para obtener hidrogeles de seda al 2 % en peso. Virus@gel o V-Navo@gel se prepararon mezclando seda-hidrogeles al 2% en peso con el mismo volumen de GFP-HSV-1 con el título de virus indicado o el mismo volumen de solución que contenía HSV-1 y Navoximod.

Para evaluar la propiedad reológica, se colocó Virus@gel (2 × 106 pfu) en un reómetro de cizallamiento dinámico para realizar experimentos de reología. El módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") de Virus@gel se midieron con la tensión y el estrés apropiados. Para evaluar la propiedad de hinchamiento, los hidrogeles de seda o Virus@gel se colocaron respectivamente en PBS, y el peso de cada uno el grupo se midió una vez al día.La relación de hinchamiento se calculó dividiendo este peso por el peso de los geles iniciales.

Se colocó Virus@gel (2 × 106 pfu) en un filtro de células con un tamaño de poro de 8 μm. El filtro se incrustó en una placa de 24 pocillos cultivada con 1 × 105 células Hepa1-6. Cada 24 h, el filtro se lavó dos veces con PBS y se incrustó en otra placa de 24 pocillos con 1 × 105 células Hepa1-6 no infectadas, mientras que las células Hepa1-6 anteriores se sometieron a imágenes de fluorescencia y análisis de citometría de flujo para determinar el porcentaje de Células positivas para GFP.

Para el establecimiento de tumores Hepa1-6 subcutáneos, se inyectó sc un inóculo de 3 × 106 células Hepa1-6 murinas en 100 μL de PBS estéril en la axila derecha de ratones hembra C57BL/6 de 6 semanas de edad. Para el establecimiento de tumores 4T1 subcutáneos, se inyectó sc un inóculo de 3 × 106 células 4T1 murinas en 100 μL de PBS estéril en la axila derecha de ratones Balb/c hembra de 6 semanas de edad. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de ~100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento inyectándoles intratumoralmente PBS, 1 × 107 pfu HSV-1, 1 × 107 pfu HSV-1/120 μg Navoximod (V-Navo) , 1 × 107 ufp GFP-HSV-1 encapsulado en hidrogel de seda al 2 % (Virus@gel), 120 μg de Navoximod en gel de seda al 2 % (Navo@gel) o 1 × 107 ufp GFP-HSV-1/120 μg Navoximod en hidrogeles de seda al 2% (V-Navo@gel), respectivamente. El crecimiento tumoral se controló cada dos días y el volumen tumoral (V) se calculó mediante la siguiente ecuación:

donde A y B son el diámetro más largo y más corto (mm) del tumor, respectivamente. La supervivencia global de los ratones se controló durante 40 días y el punto final se determinó cuando el tumor alcanzó los 1500 mm3.

Para el establecimiento del modelo de reexposición tumoral, se prepararon ratones portadores de HCC y se les administró PBS o V-Navo@gel de acuerdo con el protocolo mencionado anteriormente. El día 14 se realizó resección quirúrgica para extirpar el tumor primario. En el día 17, se inyectaron sc 3 × 106 células Hepa1-6 en 100 μl de PBS estéril en la axila opuesta de los ratones. Posteriormente, el tamaño de los tumores de nueva exposición se midió con un calibrador cada 2 días, hasta 40 días.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Mengchao Hepatobiliary de la Universidad Médica de Fujian y se realizaron de acuerdo con las pautas de la universidad.

Los tumores Hepa1-6 se trataron con PBS, Virus@gel o V-Navo@gel (1 × 107 PFU) por vía intratumoral durante 12 días. Luego, los tumores se disociaron y almacenaron en la solución de preservación de tejidos sCelLiveTM (Singleron Bio Com, Nanjing, China) en hielo después de la cirugía dentro de los 30 minutos. Los tumores se digirieron con 2 ml de solución de disociación de tejidos sCelLiveTM (Singleron) mediante el sistema de disociación de tejidos automatizado Singleron PythoN® (Singleron) a 37 °C durante 15 min. A continuación, la solución se centrifugó a 500 g durante 5 min y se suspendió suavemente con PBS. Luego, las suspensiones unicelulares (1 × 105 células/ml) se cargaron en dispositivos de microfluidos utilizando el sistema de procesamiento de células individuales Singleron Matrix® (Singleron). Posteriormente, las bibliotecas scRNA-seq se construyeron de acuerdo con el protocolo de los kits de biblioteca de ARN de células únicas GEXSCOPE® (Singleron)46. Las bibliotecas individuales se diluyeron a 4 nM y se agruparon para la secuenciación. Por último, los grupos se secuenciaron en Illumina novaseq6000 con lecturas finales emparejadas de 150 pb.

Las lecturas sin procesar se procesaron con fastQC y fastP para eliminar las lecturas de baja calidad. Cutadapt eliminó las colas poli-A y las secuencias adaptadoras. Después del control de calidad, las lecturas se asignaron al genoma de referencia mus_musculus_ensembl_92 usando STAR. Los recuentos de genes y los recuentos de UMI se adquirieron mediante el software featureCounts. Se generaron archivos de matriz de expresión para análisis posteriores en función de recuentos de genes y recuentos de UMI.

Las células se filtraron por recuentos de genes entre 200 y el 2% superior de recuentos de genes y el 2% superior de recuentos de UMI. Se eliminaron las células con más del 20% de contenido mitocondrial y se seleccionaron aleatoriamente 6000 células por muestra con las funciones de subconjunto. Usamos funciones de Seurat v3.1.2 para reducción de dimensiones y agrupamiento47. Toda la expresión génica se normalizó y escaló utilizando NormalizeData y ScaleData. Los 2000 principales genes variables fueron seleccionados por FindVariableFeautres para el análisis de componentes principales (PCA). Las células fueron separadas por FindClusters usando los 20 principales componentes principales. Se aplicó el algoritmo UMAP para visualizar celdas en un espacio bidimensional.

Seurat v3.1.2 FindMarkers seleccionó como DEG los genes expresados ​​en más del 10 % de las células en un grupo y con un log (cambio de pliegue) promedio superior a 0,25 en función de la prueba de relación de verosimilitud de Wilcox con parámetros predeterminados. Luego se determinó la identidad del tipo celular de cada grupo con la expresión de marcadores canónicos encontrados en los DEG según la base de datos SynEcoSys o la literatura previa.

Cellphone DB v2.1.0 (https://www.cellphonedb.org/) predijo la interacción célula-célula basándose en pares de ligando-receptor conocidos. El número de permutación para calcular la distribución nula de la expresión promedio del par de ligando-receptor en identidades de células aleatorias se estableció en 1000. La expresión de ligando o receptor individual se limitó mediante un límite basado en la distribución de expresión génica logarítmica promedio para todos los genes en cada tipo de célula. Los pares de interacción pronosticados con un valor de p < 0,05 y una expresión logarítmica media > 0,1 se consideraron significativos.

Para el aislamiento y análisis de las DC in vivo, los ratones se sacrificaron 8 días después del tratamiento y los ganglios linfáticos que drenaban el tumor se trituraron suavemente y se filtraron a través de filtros de 40 μm. Luego, las células se tiñeron con los anticuerpos correspondientes y se examinaron por citometría de flujo. Los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo se enumeran a continuación: Anti-CD11c-APC (eBioscience, EE. UU.); Anti-CD80-PE (eBioscience, EE. UU.); Anti-CD86-PE-Cy7 (eBioscience, EE. UU.). Para el aislamiento y análisis de TIL, los ratones se sacrificaron 8 días después del tratamiento y los tumores se diseccionaron, pesaron, trituraron mecánicamente y trataron con colagenasa (1 mg/ml, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), hialuronidasa (0,2 mg/ml, Solarbio, China). ) y Dnasa I (0,02 mg/mL, Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 2 h a 37 °C con agitación continua. A continuación, las células se pasaron a través de un filtro de 40 μm y se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque antes de teñirlas con los anticuerpos correspondientes y examinarlas mediante citometría de flujo. Los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo se enumeran a continuación: anti-CD3-APC (eBioscience, EE. UU.), anti-CD4-FITC (eBioscience, EE. UU.) y anti-CD8-PE (eBioscience, EE. UU.) para TIL. Anti-CD25-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, EE. UU.) y anti-Foxp3-PE-Cy7 (eBioscience, EE. UU.) para Tregs. Para el aislamiento y análisis de las células T de memoria, los ratones se sacrificaron en el momento definido y se diseccionaron los bazos. Las células de bazo se pasaron a través de un filtro de 40 µm y se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque antes de teñirlas con los anticuerpos correspondientes y examinarlas mediante citometría de flujo. Los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo se enumeran a continuación: Anti-CD3-APC (eBioscience, EE. UU.), anti-CD4-FITC (eBioscience, EE. UU.), anti-CD8-PE (eBioscience, EE. UU.), anti-CD44-PE-Cy7 (eBioscience, EE. UU.) y anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, EE. UU.). Para el ensayo de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT), los ratones se sacrificaron 8 días después del tratamiento, se extirparon los bazos y se aislaron las células T CD8+/CD4+ mediante clasificación. Posteriormente, se cultivaron 3 × 104 células T esplénicas clasificadas con 1,5 × 105 células Hepa1-6, y la secreción de IFN-γ resultante se detectó mediante el kit ELISPOT (Mabtech, 3321-4APT-10) siguiendo el instrumento del fabricante.

Los tumores se aislaron de los ratones el día 8 después del tratamiento. Se recogieron 30 mg de tejidos y se lisaron en tampón de lisis RIPA (Beyotime Biotechnology, China) que contenía cócteles de inhibidores de proteasa (MedChemExpress, China). Los tejidos se homogeneizaron con perlas magnéticas de 5 mm a 60 Hz durante 6 min y se centrifugaron a 16 000 g durante 5 min a 4 °C. Los sobrenadantes se sondearon para IFNγ, Granzyme B o IL12p70 mediante ELISA (Boster Biological Technology, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los tumores se recolectaron en el sacrificio el día 8 después de los tratamientos indicados y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), Ki67 (R&D System, EE. UU.), TUNEL (R&D System, EE. UU.) y tinción NK1.1 (ThermoFisher, EE. UU.). Las secciones de tumor también se sometieron a tinción de inmunofluorescencia de CD4 y CD8 por Servicebio, China. Los órganos principales se recogieron el mismo día y se sometieron a tinción con H&E.

Se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda que pesaban aproximadamente 2,5 kg. Los tejidos tumorales VX-2 congelados se descongelaron y picaron en trozos de 1 a 2 mm3 de tamaño y se implantaron en el lóbulo medio izquierdo expuesto del hígado. Se realizaron imágenes de ultrasonido para monitorear la propagación de los tumores. Después de 12 días, cuando los volúmenes promedio de los tumores se convirtieron en 200 mm3, los animales se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos y se les inyectó intratumoralmente, respectivamente, PBS, 1 × 109 ufp GFP-HSV-1/2,5 mg de Navoximod (V-Navo) o 1 × 109 ufp GFP-HSV-1/2,5 mg de Navoximod en hidrogeles de seda al 2% (V-Navo@gel). Las inyecciones se realizaron bajo la guía de ultrasonido. Después del tratamiento, se controló el peso de los animales cada cuatro días, y cuando la pérdida de peso corporal de los animales de un grupo superó el 20%, se sacrificaron los tres grupos y se disociaron los hígados.

Los lisados ​​​​celulares se prepararon en tampón de lisis RIPA (Beyotime Biotechnology, China) que contenía PMSF y un cóctel inhibidor de proteasa (MedChemExpress, China), y el contenido de proteínas de los lisados ​​​​celulares generados se determinó mediante el ensayo de proteínas BCA (TransGen Biotech, China). Se cargaron alícuotas que contenían 30 μg de proteína total en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear las membranas con BSA al 5 % durante 1 h, se probaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 °C, seguido de incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Abcam, 1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: gD (21719, Santa Cruz, 1:500), DYKDDDDK-Tag (3P8, Abmart, 1:1000), GAPDH (AB0037, Abways, 1:10000), IDO1 (66528, Proteintech, 1: 1000).

El tamaño de la muestra se determinó a partir de los resultados de un estudio preliminar. El número utilizado para cada experimento se muestra en la leyenda de la figura. Múltiples estudios independientes confirmaron resultados consistentes. El análisis estadístico de los datos se analizó a través de una o dos vías de varianza (ANOVA) para la comparación entre múltiples grupos o la prueba t de Student pareada de dos colas para la comparación entre dos grupos. Los datos de supervivencia se analizaron mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). *p < 0,05 se fijó como estadísticamente significativo. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Todos los datos se analizaron usando GraphPad Prism y se mostraron como medias ± SEM a través de al menos tres experimentos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos relacionados con este estudio se han incluido en el artículo y su información complementaria. Los datos de origen para los gráficos y cuadros de las figuras están disponibles como Datos complementarios. Las imágenes de transferencias occidentales originales sin recortar y las estrategias de activación de FACS se incluyen en la Fig. 10 complementaria y la Fig. 11 complementaria. Los datos de RNA-seq se depositaron en la base de datos Genome Sequencing Achieve for Human (https://ngdc.cncb.ac.cn/ gsa-human/) con el número de acceso HRA000464. Los datos de ScRNA-seq se depositaron en la base de datos Genome Sequencing Achieve (https://hgdc.cncb.ac.cn/gsa) con el número de acceso CRA008926. Otros datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 62175031 a XL y 82103317 a QZ); Proyecto de fondo de ciencia juvenil excepcional de la provincia de Fujian (2022J06034 a DZ). Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia China de Fujian (Subvención No. 2020J02010 a XL, 2020J011173 a QZ); el Proyecto de Capacitación de Talentos Jóvenes y de Mediana Edad de la Comisión Provincial de Salud de Fujian (2020GGA073 a QZ); Fondos conjuntos para la innovación de la ciencia y la tecnología de la provincia de Fujian (Subvención No. 2020Y9047 a QZ, 2021Y9216 a DZ); La Fundación Científica de la Comisión de Salud Municipal de Fuzhou (Subvención No. 2021-S-wp1 a YZ). Agradecemos sinceramente a Weilin Liu de la Facultad de Medicina de Rehabilitación de la Universidad de Medicina Tradicional China de Fujian por ayudar en la construcción y el diagnóstico del modelo animal en nuestro estudio.

Estos autores contribuyeron por igual: Qiuyu Zhuang, Binyu Zhao.

United Innovation of Mengchao Hepatobiliary Technology Key Laboratory de la provincia de Fujian, Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou, 350025, PR China

Qiuyu Zhuang, Binyu Zhao, Zhiwen Lin, Yuzhi Liang, Qingfu Zhao, Yunhao Wang, Naishun Liao, Haibin Tu, Youshi Zheng, Yongyi Zeng, Da Zhang y Xiaolong Liu

Centro Mengchao Med-X, Universidad de Fuzhou, Fuzhou, 350116, República Popular China

Qiuyu Zhuang, Youshi Zheng, Da Zhang y Xiaolong Liu

The Liver Center of Fujian Province, Fujian Medical University, Fuzhou, 350025, PR China

Qiuyu Zhuang, Binyu Zhao, Zhiwen Lin, Yuzhi Liang, Qingfu Zhao, Yunhao Wang, Naishun Liao, Haibin Tu, Youshi Zheng, Hengkai Chen, Yongyi Zeng, Da Zhang y Xiaolong Liu

El primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Fujian, Fuzhou, 350025, PR China

Hengkai Chen y Yongyi Zeng

CAS Key Laboratory of Design and Assembly of Functional Nanostructures, Fujian Institute of Research on the Structure of Matter, Chinese Academy of Sciences, Fuzhou, 350002, PR China

Xiaolong Liu

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Q. Zhuang, DZ y XL diseñaron el estudio. Q. Zhuang, BZ, ZL, YL, Q. Zhao, YW, NL, HT, YZ, DZ y HC realizaron los experimentos. Q. Zhuang, BZ, YZ, DZ y XL analizaron los resultados. Q. Zhuang, BZ, YZ, DZ y XL escribieron y revisaron el manuscrito. XL supervisó el estudio.

Correspondencia a Da Zhang o Xiaolong Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Yingying Hu y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: [Zhijuan Qui y Anam Akhtar]. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Zhuang, Q., Zhao, B., Lin, Z. et al. Navoximod modula la replicación local de HSV-1 para remodelar el microambiente inmunitario tumoral para mejorar la inmunoterapia a través de un hidrogel inyectable. Commun Biol 6, 621 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04983-z

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Recibido: 06 noviembre 2022

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04983-z

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