Inactivador de DSF FadD homólogo de RpfB regulado positivamente en Bradyrhizobium japonicum en condiciones limitantes de hierro

Aug 29, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8701 (2023) Citar este artículo

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La bacteria fitopatógena Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) causa pudrición negra y otras enfermedades de las plantas. Xcc detecta el factor de señal difusible (DSF) como una señal de detección de quórum (QS) que media principalmente la captación de hierro y la virulencia. RpfB desactiva DSF en este circuito DSF-QS. Examinamos los perfiles diferenciales de expresión génica de Bradyrhizobium japonicum en condiciones bajas versus altas de hierro y descubrimos que fadD e irr estaban regulados al alza en condiciones bajas de hierro (cambio log2 de 0,825 y 1,716, respectivamente). Además de tener patrones de plegamiento de proteínas similares y similitudes de dominio funcional, FadD compartió una similitud de secuencia del 58 % con RpfB de Xcc. Los complejos RpfB-DSF y FadD-DSF tenían puntajes de acoplamiento molecular SWISSDock de -8,88 kcal/mol y -9,85 kcal/mol, respectivamente, y los resultados de la simulación de dinámica molecular de 100 ns estaban de acuerdo con los resultados del acoplamiento. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas entre las energías de unión de FadD-DSF y RpfB-DSF, lo que indica una posible rotación de DSF dependiente de FadD. La red de interacción proteína-proteína mostró que FadD se conectaba indirectamente con la permeasa transportadora ABC (ABCtp), que también estaba regulada positivamente (cambio log2 de 5,485). Especulamos que la condición baja en hierro puede ser un estímulo ambiental mimético para la regulación positiva de fadD en B. japonicum para desactivar DSF, inhibir la absorción de hierro y la virulencia de los vecinos productores de DSF. Este hallazgo brinda una nueva opción de usar B. japonicum o un B. japonicum mejorado genéticamente como un posible agente de biocontrol contra Xcc, con el beneficio adicional de las propiedades que promueven el crecimiento de las plantas.

El hierro es el elemento más ubicuo en la corteza terrestre después del oxígeno, el silicio y el aluminio. El hierro suele existir en estado de oxidación ferroso (Fe2+) o férrico (Fe3+)1. El hierro férrico tiene una solubilidad relativamente baja, aunque es la forma predominante en el ambiente oxigenado de la Tierra, y esto plantea un desafío para las bacterias con metabolismo aeróbico. A pH bajo, el hierro ferroso más soluble es el más abundante en un ambiente anaeróbico o microaeróbico2. El hierro es esencial para la actividad de las enzimas reguladoras y metabólicas, por lo que es fundamental para la fisiología bacteriana. Sin embargo, el hierro puede ser tóxico para las células debido a su potencial para transportar electrones a pH fisiológico. Las bacterias han desarrollado mecanismos para recolectar activamente hierro del medio ambiente cuando el hierro escasea y para controlar la disponibilidad de hierro libre intracelular cuando el hierro es abundante3. Esta homeostasis del hierro es crucial tanto para la virulencia como para los procesos celulares normales1. El regulador de absorción férrico (Fur) es un regulador transcripcional global de la homeostasis, la virulencia y el estrés oxidativo del hierro4. Fur ha sido ampliamente investigado en Escherichia coli5 y se ha demostrado que regula la expresión dependiente de hierro de más de 90 genes6. Fur funciona como un represor positivo porque cuando interactúa con el hierro (su co-represor) suprime la transcripción y cuando el hierro está ausente deprime la transcripción6. Fur es una proteína de unión a ADN homodímera que se une a un ion ferroso por subunidad. A bajas concentraciones de hierro, la afinidad de unión al ADN de apo-Fur (Fur sin hierro) es aproximadamente 1000 veces menor que la de Fur y su actividad se reduce, lo que da como resultado la absorción de hierro, la supresión del ARN pequeño de RyhB, la disminución del almacenamiento de hierro y la disminución de síntesis de proteínas de hierro6. Los sideróforos son moléculas quelantes de hierro férrico extracelulares que son sintetizadas por bacterias para la adquisición de hierro7. Las cepas bacterianas que son incapaces de producir sideróforos a menudo utilizan sideróforos producidos por otras cepas bacterianas, lo que les da una ventaja competitiva entre especies o condiciones limitantes de hierro8. Las bacterias tienen otros mecanismos de adquisición de hierro, incluida la absorción de hemo y un sistema de transporte de hierro ferroso2,9. Sin embargo, se descubrió que las cepas mutantes fur carecían de una homeostasis adecuada del hierro, y se detectó una alta concentración de hierro intracelular como resultado de la producción de sideróforos constantemente alta4. En las plantas hospederas, las cepas mutantes fur habían disminuido la resistencia al estrés oxidativo y disminuido los rasgos de virulencia4,10. Estos hallazgos resaltan la importancia del hierro y el Fur en la patogenicidad de las bacterias fitopatógenas.

Las rizobacterias son α-proteobacterias que habitan en el suelo y pueden establecer relaciones simbióticas con plantas leguminosas (p. ej., soja)11. En una relación simbiótica, las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas promueven el desarrollo de las plantas a través de una variedad de mecanismos, que incluyen, entre otros, la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfato, la producción de fitohormonas, la producción de antibióticos y la interferencia de detección de quórum (QS)12. La mayoría de las bacterias utilizan QS como un mecanismo de comunicación dependiente de la densidad celular13. QS está mediado principalmente por N-acil homoserina lactona, y la vida social de las bacterias está dictada en parte por QS. En bacterias fitopatógenas como Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), el QS está mediado por miembros de la familia del factor de señal difusible (DSF), como DSF, ácido cis-2-dodecenoico (BDSF), ácido cis,cis-11-metildodeca-2,5-dienoico (IDSF ), el ácido trans-2-decenoico (SDSF) y el factor promotor de la reanimación RpfB regulan el recambio del DSF14. Las secuencias de ligasa CoA de ácidos grasos de cadena larga (FadD) de Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti y Agrobacterium tumefaciens son homólogas con la secuencia RpfB de Xcc15. La interrupción de las señales de QS por conversión enzimática de homoserina lactona o DSF se denomina extinción de quórum, y QQ a menudo mejora la aptitud competitiva de las especies bacterianas16. Bradyrhizobium japonicum es una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas12. En la cepa LO de B. japonicum, la homeostasis del hierro y los genes regulados por el hierro están regulados por la proteína reguladora de la respuesta al hierro (Irr) y no se limitan a la biosíntesis del hemo5. En este trabajo, analizamos los niveles diferenciales de expresión génica en la cepa LO de B. japonicum en condiciones bajas y altas de hierro, usando perfiles de expresión de micromatrices del conjunto de datos NCBI Gene Expression Omnibus (GEO: GSE4143) e interacciones proteína-proteína usando STRING. Descubrimos que la expresión del gen fadD de B. japonicum estaba regulada positivamente en condiciones de bajo contenido de hierro (log2 fold change (FC) 0,825). También encontramos que las secuencias de aminoácidos de B. japonicum FadD y Xcc RpfB compartían una identidad del 58%, y que la energía de unión de FadD-DSF era significativamente mayor que la de RpfB-DSF, lo que indica una posible rotación de DSF dependiente de FadD. Especulamos que la condición baja en hierro puede ser un estímulo ambiental mimético para B. japonicum que regula al alza la fadD para desactivar DSF, inhibir la absorción de hierro y la virulencia de los vecinos productores de DSF.

El análisis del conjunto de datos GEO GSE4143 mostró que 642 genes se expresaron de forma significativamente diferencial (DEG) en condiciones de bajo contenido de hierro (hierro bajo versus alto) (Fig. 1). Solo 457 de los 642 DEG se utilizaron para análisis adicionales (Tabla complementaria S1). Entre los 642 DEG, 384 estaban regulados al alza y 258 estaban regulados a la baja (Fig. 2a). Los genes fadD e irr de B. japonicum estaban regulados al alza (log2 FC 0,825 y 1,716, respectivamente) (Fig. 2b). En particular, el gen de la permeasa transportadora ABC (ABCtp, blr3355) también se reguló positivamente (log2 FC 5.485).

Genes expresados ​​diferencialmente entre Bradyrhizobium japonicum cultivados en condiciones bajas y altas de hierro. (a) Diagrama de volcán. (b) Gráfica de diferencia de medias que muestra el cambio de pliegue log2 (eje x) frente a los valores de expresión log2 promedio (eje y). Se consideró que los genes se expresaban de forma significativamente diferencial cuando el valor p ajustado de la tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg era <0,05. ( c ) Diagrama de Venn de la superposición en genes expresados ​​​​de manera significativamente diferencial entre las condiciones bajas y altas de hierro. En este análisis se utilizó el conjunto de datos Gene Expression Omnibus GSE4143. Los gráficos se generaron utilizando la herramienta de análisis GEO2R y se adaptaron para una mejor legibilidad.

Genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y vías metabólicas KEGG enriquecidas. (a) Gráfico de contingencia de los 642 DEG entre las condiciones de hierro alto y bajo. ( b ) Niveles de expresión diferencial de irr y fadD en condiciones con bajo contenido de hierro en comparación con condiciones con alto contenido de hierro. ( c ) Rutas metabólicas KEGG de los DEG sin filtro de corte. La vía de detección de quórum tenía una relación de enriquecimiento muy baja de 0,01 con un gen de entrada (fadD) y 19 genes de fondo. Las vías KEGG se dividieron en ocho grupos principales (C1-C8) según sus funciones.

El análisis de enriquecimiento de rutas de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) con el FDR de Benjamini-Hochberg (P < 0.05) de los DEG mostró que la mayoría de los genes regulados a la baja estaban involucrados en el ensamblaje de flagelos, ribosomas, fosforilación oxidativa, rutas metabólicas, fijación de carbono en organismos fotosintéticos, el metabolismo de la porfirina y la clorofila, el metabolismo del carbono, el metabolismo microbiano en diversos entornos, el metabolismo del glioxilato, el dicarboxilato y la biosíntesis de metabolitos secundarios (Tabla complementaria S2), mientras que la mayoría de los genes regulados al alza estaban involucrados en la retransmisión de azufre (moaE, moaD, mnmA) y resistencia a betalactámicos (acrB, ampC, acrA) (Tabla complementaria S3). Además, utilizamos el Sistema de anotación basado en ortología KEGG (KOBAS) también sin la configuración del filtro Benjamini-Hochberg FDR (p <0.05) e identificamos una vía QS que tenía un gen (fadD) y 19 genes de fondo (Fig. 2c).

Construimos una gran red de interacción proteína-proteína (PPI) de los DEG (Fig. S1 complementaria) y descubrimos que las proteínas codificadas en los 50 nodos centrales principales estaban involucradas en dos vías importantes de KEGG, a saber, el ribosoma y las vías de ensamblaje flagelar. La proteína rpmC en la ruta del ribosoma y el nodo 2734684 en las rutas de ensamblaje flagelar conectan estas dos rutas metabólicas (Fig. 3a). En particular, los 15 nodos de cuello de botella principales incluían la proteína Irr, mientras que FadD no estaba entre los 50 centros principales o los 15 nodos de cuello de botella (Fig. 3b). La red PPI se compone de subredes, que incluyen FadD, ensamblaje flagelar, ribosomas y grupos de nodulación de raíces (Figura complementaria S1). FadD interactúa con nodos específicos, a saber, 27354240, 27354241, 27354239, 27354242, 27352300, 27349302, 27351614, 27351617, 27348347 (Fig. 3c). Un análisis separado basado en STRING17 del grupo FadD PPI identificó vías de transportador QS y ABC significativas con valores de p ajustados por FDR de 7.64e-09 y 2.82e-05, respectivamente (Tabla 1). Además, FadD y 27354240 participaron exclusivamente en la ruta QS, mientras que 27354239, 27354241, 27354242, 27352300, 27349302 y 27351614 participaron en las rutas del transportador QS y ABC. Además, los nodos 27351614 y 27348347 participaron en varias vías, incluida la homeostasis del hierro celular (Fig. 3c). Los resultados también mostraron que FadD estaba conectado indirectamente con ABCtp, que estaba regulado al alza (log2 FC 5.485) (Fig. 3d).

Red de interacción proteína-proteína (PPI) de los genes expresados ​​​​diferencialmente y nodos centrales y de cuello de botella. (a) Los 50 principales nodos centrales de la red PPI. Los nodos del concentrador de conexión están en cuadros azules. (b) Los 15 principales nodos de cuello de botella en la red PPI. La proteína Irr está abajo a la derecha. ( c ) El grupo FadD en la red PPI se separó y estudió usando STRING. Los nodos están en varios colores según las vías involucradas: rojo, detección de quórum (bja02024) 58, 59, 60; azul, transportadores ABC (bja02010) 58,59,60; mixto, incluyendo ferredoxina NADP reductasa y bacterias; y amarillo, homeostasis de iones de hierro celular (grupo de red local (STRING), CL: 1531). ( d ) Niveles de expresión diferencial de genes de nodo involucrados en varias vías, incluidas la detección de quórum y las vías del transportador ABC.

La alineación de las secuencias de aminoácidos FadD y Xcc RpfB de B. japonicum mostró que compartían un 58 % de similitud (Figura complementaria S2) y tenían dominios de familia de proteínas idénticos en posiciones muy similares en sus secuencias (Tabla complementaria S4). Una alineación de secuencias múltiples y un árbol filogenético mostraron que B. japonicum FadD se parecía significativamente a otras secuencias de aminoácidos de FadD bacterianas ya conocidas por ser homólogas a la secuencia Xcc RpfB (Fig. 4). La evaluación estructural de las estructuras proteicas predichas AlphaFold18 de RpfB (AF-Q8P9K5-F1) y FadD (AF-A0A0A3XRM6-F1) utilizando la herramienta RRDistMaps en UCSF Chimera19 detectó similitudes en sus estructuras tridimensionales (Fig. S2 complementaria) y Xcc RpfB y B. japonicum FadD tenían puntuaciones TM-align20 de 0,95995 y 0,95828 respectivamente, lo que confirma que las estructuras eran muy similares.

Comparación de las secuencias de aminoácidos FadD de Bradyrhizobium japonicum, especies bacterianas relacionadas y RpfB de Xcc. (a) Alineación de secuencias múltiples y (b) árbol filogenético. Los valores de arranque se muestran junto a las ramas.

Las puntuaciones de acoplamiento molecular de RpfB-DSF y FadD-DSF utilizando CB-Dock221 y AutoDock Vina22 no fueron muy diferentes (Fig. 5), mientras que las puntuaciones de SWISSDock23 y fastDRH24 difirieron significativamente. Específicamente, RpfB-DSF tuvo una puntuación SWISSDock de -8,88 kcal/mol y puntuaciones fastDRH MM-PBSA y MM-GBSA de -22,27 y -34,07 kcal/mol respectivamente, mientras que FadD-DSF tuvo una puntuación SWISSDock de -9,85 kcal/mol y puntuaciones fastDRH MM-PBSA y MM-GBSA de −34,02 kcal/mol y −38,07 kcal/mol respectivamente (Tabla 2). Los residuos de contacto entre RpfB y DSF fueron PRO84, ASN85, PRO108, LEU109, ILE130, ASN132, PHE133, LEU154, LEU176, THR259, ALA260, LEU261, PRO262, LEU263, TYR264, ILE286, SER287, ASN288, PRO289 y ARG290, mientras que los residuos de contacto entre FadD y DSF fueron ASN236, TRP239, LEU240, PHE265, ALA269, LEU273, ILE331, ASN333, GLY334, GLY335, GLY336, MET337, GLfY358, TYR359, GLY360, LEU361, PRO366, THR367, THR369 y CYS370 (suplementario Figura S3). Además, se identificaron los 10 principales residuos de puntos críticos potenciales y los 30 principales residuos del mapa de calor (Figura complementaria S4) en función del análisis de descomposición de energía por residuo de múltiples posiciones de acoplamiento del ligando24. Por lo tanto, ellos (Fig. S4 complementaria) pueden ser bastante útiles para futuros esfuerzos de diseño de fármacos contra RpfB Xcc.

Interacciones biofísicas entre los receptores RpfB y FadD y el ligando DSF mediante simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular (MD). (a,b) Acoplamiento molecular entre DSF y RpfB de Xcc (a), y entre DSF y FadD de Bradyrhizobium japonicum (b). DSF está indicado por las estructuras rojas de bolas y palos. ( c, d ) RMSD de los receptores y ligandos en los complejos. ( e, f ) RMSF de los receptores y ligandos en los complejos. ( g ) Radio de giro (Rg) de las proteínas receptoras. ( h ) Números de enlaces H y los residuos de aminoácidos involucrados en los enlaces H calculados utilizando los complejos receptor-ligando generados durante las simulaciones de dinámica molecular de 100 ns. El umbral se representa como una línea discontinua.

Para confirmar los resultados del acoplamiento molecular, se estimó la energía libre de unión basándose en modelos de solvatación implícita para las proteínas FadD y RpfB complejadas con DSF. Los cálculos de MM-PBSA/GBSA utilizando trayectorias MD de 100 ns mostraron que la afinidad de unión para FadD-DSF era mucho mayor que la de RpfB-DSF (Tabla 2), lo que confirmó los resultados del acoplamiento molecular. Las fuerzas de van der Waals fueron los principales contribuyentes a la afinidad proteína-ligando debido a la naturaleza lipofílica de la molécula del ligando.

Para explorar los movimientos de los dos complejos durante las simulaciones, los valores de desviación cuadrática media (RMSD) y fluctuación (RMSF), y el radio de giro (Rg) se trazaron frente al tiempo (Fig. 5c-g). Los valores de RMSD de FadD-DSF fueron más altos (RMSD = 3,64 Å) que los de RpfB-DSF (RMSD = 2,78 Å), lo que indica que FadD se desvió más que RpfB del estado inicial (Fig. 5c). El ligando RMSD en el complejo FadD-DSF permaneció sin cambios en el umbral de 1.0 Å, mientras que el ligando RMSD en el complejo RpfB-DSF cambió mucho probablemente porque DSF se liberó del sitio de unión (Fig. 5d). Los valores de RMSF del receptor identificaron residuos de aminoácidos asociados con la alta flexibilidad de las regiones N- y C-terminal de RpfB (Fig. 5e). Los valores de RMSF de DSF mostraron patrones de flexibilidad similares a los valores de RMSF para los receptores; es decir, DSF era más flexible en el complejo RpfB-DSF que en el complejo FadD-DSF (Fig. 5f). Los valores de Rg mostraron que RpfB fue más compacto que FadD en los complejos; es decir, los valores de Rg fueron más altos para FadD que para RpfB (Fig. 5g).

Se evaluó el número de enlaces H entre los receptores y sus ligandos para determinar la contribución de los enlaces H a la afinidad de unión. La afinidad de unión fue alta entre FadD y DSF, aunque solo dos aminoácidos (Gly336 y Gly360) estuvieron involucrados en la formación de enlaces H. Sin embargo, nueve residuos de aminoácidos estuvieron involucrados en la formación de enlaces H entre RpfB y DSF, la afinidad de unión fue baja probablemente porque el ligando se liberó del sitio de unión (Fig. 5h).

Las bacterias suelen estar rodeadas de varias cepas y especies que compiten por los limitados recursos vitales25. Por lo tanto, las bacterias han desarrollado estrategias para diezmar y desalojar a sus vecinas, incluidas, entre otras, secreciones para reunir recursos (p. ej., sideróforos para el hierro), lesionar o envenenar las células vecinas26 y establecer microcolonias mientras evitan que otros organismos lo hagan27. Las biopelículas son microcolonias agregadas de células microbianas asociadas a la superficie encerradas por una sustancia polimérica extracelular (EPS) y gobernadas principalmente por QS28. QS también tiene un papel crucial en la regulación de la virulencia y la formación de biopelículas en Xcc29. Por el contrario, las rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas, como B. japonicum, pueden promover el crecimiento de las plantas mediante la interferencia de QS o la extinción del quórum de las bacterias fitopatógenas adyacentes10,12. Recientemente, ha habido un enfoque importante en las señales QS, incluidas las señales de la familia DSF30, y se descubrió que QS está asociado con ventajas o interacciones competitivas26. DSF y BDSF son mediadores del proceso QS en Xcc14, y RpfB puede desactivar DSF mediante β-oxidación a través de su actividad ligasa de acil-CoA graso31. Además, DSF puede afectar potencialmente el desarrollo, el crecimiento y la inmunidad de las plantas huésped31. En Xcc, altas concentraciones extracelulares de DSF activan el sistema RpfC-RpfG a altas densidades celulares, aliviando la inhibición de c-di-GMP sobre el factor de transcripción global Clp que regula la expresión de varios factores de virulencia y la absorción de hierro32. Xcc rpfF produjo DSF y el mutante homólogo de rpfF Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) deficientes en crecimiento y producción de DSF33. Xoo es una bacteria fitopatógena que causa el tizón bacteriano en las plantas de arroz. Las cepas mutantes homólogas de Xoo rpfF mostraron una susceptibilidad inusual a la tetraciclina en condiciones bajas en hierro y resistencia a la tetraciclina con suplementos de hierro33. Se ha informado sobre la patogenicidad dependiente del hierro de Xoo en plantas de arroz34. Xcc, puede producir xantoferrina, un sideróforo que es necesario para la máxima virulencia y crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro35. La xantoferrina puede unirse al hierro férrico y mejorar el crecimiento de Xcc en las plantas huésped35. Estos hallazgos muestran la importancia del hierro y el sistema QS dependiente de DSF para la manifestación de los rasgos de virulencia de las bacterias fitopatógenas.

Las secuencias FadD de E. coli, S. meliloti y A. tumefaciens son homólogas de la secuencia Xcc RpfB15. Sin embargo, la homología entre B. japonicum FadD y Xcc RpfB no se ha informado previamente. La alineación de las secuencias de aminoácidos FadD y Xcc RpfB de B. japonicum mostró que compartían un 58% de similitud (Fig. S2 complementaria). La similitud de secuencia ofrece información sobre las funciones de las proteínas36. Las puntuaciones de TM-align de las estructuras tridimensionales de dos proteínas modelo se pueden obtener comparando sus equivalencias de residuos20. Xcc RpfB y B. japonicum FadD tenían puntuaciones de TM-align de 0,95995 y 0,95828 respectivamente, lo que es indicativo de patrones de plegamiento de proteínas similares. Por lo tanto, además de compartir similitudes de secuencia, compartieron patrones de plegamiento de proteínas y dominios de familias de proteínas (Tabla complementaria S4), lo que indica posibles similitudes funcionales entre las dos proteínas. Además, el RMSD de RpfB en RpfB-DSF fue más bajo que el RMSD de FadD en FadD-DSF a lo largo de las trayectorias de MD. RMSD mide la diferencia entre las estructuras inicial y final de una proteína. Las discrepancias durante la trayectoria MD de una estructura proteica pueden indicar su estabilidad conformacional37. Para FadD, las fluctuaciones de RMSD no excedieron aproximadamente 4 a 6 Å (aproximadamente 40 a 100 ns), lo que indica un rango de fluctuación pequeño. Para el ligando en los dos complejos, las fluctuaciones de RMSD mostraron tendencias opuestas. Las fluctuaciones de RMSD para DSF fueron mayores en el complejo RpfB-DSF que en el FadD-DSF a lo largo de las trayectorias de MD (Fig. 5). Las pequeñas fluctuaciones de RMSD son indicativas de una unión estable al ligando38. RMSF cuantifica los desplazamientos promedio de los residuos de aminoácidos desde un punto de referencia sobre una trayectoria MD y, por lo tanto, RMSF puede identificar las regiones estructurales que se desvían más de su estructura inicial39. En particular, algunas regiones proteicas de RpfB-DSF y FadD-DSF, aproximadamente 150-160 y 455 hasta el extremo C-terminal, exhibieron fluctuaciones similares y, en promedio, la RMSF de RpfB-DSF y FadD-DSF fue muy similar, lo que indica interacciones receptor-ligando satisfactorias. El Rg indica la distribución de los átomos alrededor del eje de una proteína, y es una medida de la distancia entre el punto en que gira y el punto donde la transferencia de energía tiene el mayor impacto posible40. Para RpfB en RpfB–DSF, el Rg se mantuvo entre 23,5 Å y 24,5 Å. Para FadD en FadD–DSF, el Rg comenzó a fluctuar después de 40 ns y luego se mantuvo cerca de 25 Å hasta 100 ns. Los más de 500 enlaces H que se predijo que formaría GLY336 de FadD-DSF son indicativos de la dominancia única de GLY336 en las interacciones receptor-ligando, mientras que se predijo que numerosos residuos de aminoácidos formarían enlaces H en RpfB-DSF . Debido a que los enlaces H ayudan a crear y estabilizar las estructuras proteicas41, la formación de enlaces H a lo largo de la trayectoria MD sugiere interacciones estables entre el receptor y el ligando en RpfB-DSF y FadD-DSF.

Se utilizan diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión génica entre dos condiciones experimentales para identificar DEGs42. Identificamos 642 DEG en B. japonicum comparando los niveles de expresión génica en condiciones bajas y altas de hierro (Fig. 1). La proteína Irr y FadD son importantes para la homeostasis del hierro y el QS o extinción del quórum. Encontramos que fadD e irr de B. japonicum estaban regulados al alza en condiciones bajas en hierro (log2 FC 0.825 y 1.716, respectivamente). Además, el informe indicó que la proteína Irr era necesaria para una percepción adecuada del estado del hierro celular5. Y se encontró que la ausencia de una respuesta normal al hierro y genes asociados con el hierro en una cepa mutante irr disminuye el contenido total de hierro celular5. Estas características de la proteína Irr explican la regulación positiva de irr en condiciones de bajo contenido de hierro. Sin embargo, la importancia de la regulación al alza de fadD en B. japonicum en condiciones bajas en hierro no se ha explicado en estudios anteriores.

En el presente estudio, el análisis de enriquecimiento funcional de la lista de genes identificó el ensamblaje flagelar y las rutas de los ribosomas como las dos rutas principales con valores de p ajustados por FDR < 0,05 (Tabla complementaria S2), y los genes asociados con estas dos rutas metabólicas se encontraban entre los 50 principales nodos centrales en la red PPI (Fig. 3a). Además, se encontró que los nodos centrales que conectan estas dos vías, rpmC de la red de ribosomas y 27348641 de la red de ensamblaje flagelar, son de importancia crítica (Fig. 3a). Sin embargo, solo la proteína Irr se encontraba entre los 15 principales nodos de cuello de botella de toda la red PPI (Fig. 3b), aunque FadD no se encontraba entre los 50 principales nodos de cuello de botella/hub. En particular, el nivel de expresión de fadD (log2 FC 0,825) fue casi la mitad del de la proteína Irr (log2 FC 1,716). Este hallazgo plantea la cuestión de por qué se produce una alta expresión de fadD en B. japonicum cuando la disponibilidad de hierro estaba restringida.

En las bacterias, el hierro desempeña funciones fisiológicas cruciales en la replicación del ADN, la transcripción, el metabolismo, la producción de energía a través de la respiración y la patogenicidad3. Las condiciones de bajo contenido de hierro pueden desencadenar procesos que impiden la absorción de hierro por parte de otros microorganismos, lo que garantiza condiciones óptimas para la supervivencia de uno mismo. Se encontró que el factor de transcripción de unión al hierro férrico XibR, que controla coordinadamente la expresión de genes relacionados con el metabolismo del hierro, la quimiotaxis y la motilidad flagelar, es necesario para la virulencia óptima de Xcc43. En condiciones bajas en hierro, las cepas mutantes de XibR mostraron un crecimiento reducido y concentraciones de hierro intracelular disminuidas43. La importancia del metabolismo del hierro en la fisiopatología de las bacterias se ve respaldada por el hallazgo de que el potente bactericida Xinjunan (dioctildietilentriamina) actuó alterando el metabolismo celular del hierro44.

Además de fadD, se ha demostrado que otros genes como fadE y fadR desempeñan funciones críticas en la β-oxidación en E. coli45. Curiosamente, también se encontró que fadE, fadF, fadG, fadH, fadL y el regulador transcripcional fadR están involucrados en el metabolismo de los lípidos bacterianos46, pero ninguno de estos genes se expresó de manera diferencial en B. japonicum cuando se compararon condiciones bajas versus altas de hierro (Tabla complementaria S1). Durante condiciones de limitación de recursos, las bacterias generalmente optan por vías energéticamente eficientes y operones como el operón de lactosa en E. coli47 suelen evitar la transcripción no esencial. Descubrimos que fadD estaba regulado al alza en B. japonicum en condiciones de bajo contenido de hierro (Fig. 3c), lo que implica que la alta expresión de fadD puede atribuirse a otros factores. El análisis basado en STRING del grupo FadD en la red PPI (Figura complementaria S1) encontró dos vías cruciales de KEGG: las vías del transportador QS y ABC (Tabla 1). Sin embargo, las predicciones de rutas basadas en STRING y KEGG tienen limitaciones porque estos métodos no están optimizados ni adaptados para interacciones de múltiples especies. De hecho, una comunidad bacteriana homogénea o isogénica es rara porque una amplia gama de microorganismos son habitantes típicos de las bacterias48. Además, las bacterias pueden dañar y superar a sus vecinas cuando los recursos son escasos a través de sus vías metabólicas o de señalización celular27. Entre los otros DEG, ABCtp (blr3355) estaba regulado al alza (log2 FC 5.485) y estaba indirectamente conectado a FadD (Fig. 3d). Las permeasas son proteínas transportadoras de membrana36 que pueden transportar proteínas fuera de las células. La alta expresión de ABCtp (blr3355) en condiciones bajas en hierro indica que se requería y probablemente estaba relacionado con el transporte extracelular de FadD. Además, se encontró que el transportador ABC estaba regulado al alza en Streptococcus pneumoniae por dos mecanismos QS diferentes49.

QS juega un papel importante en la rivalidad entre especies50 y la cooperación51, y se ha informado la inhibición de QS entre especies52. RpfB desactiva DSF en Xcc14, lo que puede interrumpir el circuito de señalización mediado por di-GMP cíclico y Clp de la absorción de hierro celular31,32,53,54,55,56 similar a Xanthomonas campestris (Fig. 6a). Además, B. japonicum FadD y Xcc RpfB son homólogos (Fig. 4) y se detectó una diferencia significativa en las energías de unión de FadD-DSF y RpfB-DSF (Tabla complementaria S3), lo que indica una posible rotación de DSF dependiente de FadD (Fig. 6b). Por lo tanto, especulamos que la condición baja en hierro puede ser un estímulo ambiental mimético para la regulación positiva de fadD en B. japonicum para desactivar DSF e inhibir la absorción de hierro y la virulencia de los vecinos productores de DSF. Esto puede explicar por qué fadD y ABCtp aumentaron en B. japonicum en condiciones de bajo contenido de hierro.

Cascada de señalización molecular propuesta de respuestas celulares mediadas por DSF. (a) Detección de quórum mediada por DSF en Xanthomonas campestris, obtenida de KEGG (bja02024)58,59,60 (b) Posible modo de acción de la comunicación entre especies a través de DSF de Xcc y el homólogo RpfB FadD de Bradyrhizobium japonicum.

Analizamos la expresión génica diferencial de B. japonicum en condiciones bajas y altas de hierro y encontramos que los genes FadD, Irr y ABCtp estaban regulados al alza (log2 FC 0.852, 1.724 y 5.485, respectivamente). La red PPI indicó que FadD estaba indirectamente conectado con ABCtp. Identificamos patrones de plegamiento de proteínas similares, dominios funcionales y una similitud de secuencia del 58% entre FadD de B. japonicum y RpfB de Xcc. También identificamos las vías del transportador QS y ABC mediante el análisis basado en STRING de los DEG. El acoplamiento molecular mostró una diferencia significativa en las energías de enlace entre FadD-DSF y RpfB-DSF, lo que indica una posible rotación de DSF dependiente de FadD que fue respaldada por las simulaciones MD. Especulamos que las condiciones bajas de hierro pueden ser un estímulo ambiental mimético para la regulación positiva de fadD en B. japonicum para desactivar la absorción de hierro mediada por DSF y la virulencia de los vecinos productores de DSF. Nuestros resultados brindan una nueva opción de usar B. japonicum o B. japonicum modificado genéticamente como agente de biocontrol contra las enfermedades de las plantas causadas por Xcc. Sin embargo, para ayudar a asegurar la producción agrícola frente al cambio climático, la investigación exploratoria de edición de genes FadD puede ser un enfoque importante para futuros estudios.

Se realizó una búsqueda bibliográfica con combinaciones de palabras clave como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, PGPR, Bradyrhizobium japonicum, detección de quórum, hierro y nodulación utilizando Google Scholar (https://scholar.google.com/) y PubMed (https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). También buscamos los conjuntos de datos de micromatrices en NCBI Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y seleccionamos el conjunto de datos GSE4143 para el análisis (Tabla 3). Las muestras de GEO GSM94778, GSM94780 y GSM94781 se cultivaron en condiciones de bajo contenido de hierro, y las muestras de GEO GSM94783, GSM94784 y GSM94785 se cultivaron en condiciones de alto contenido de hierro. Brevemente, la cepa LO de B. japonicum se cultivó en un medio GSY modificado sin fuente de hierro exógena para producir una concentración de hierro de 0,3 µM en el medio (condición baja en hierro) y en un medio GSY modificado suplementado con FeCl3.6H2O 12 µM (condición alta en hierro). condición) 5.

Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre B. japonicum cultivados en condiciones bajas y altas de hierro se identificaron utilizando GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)57. Los genes dentro de los criterios de corte del valor P ajustado por FDR <0,05 (Benjamin-Hochberg) se consideraron DEG. La transformación de registro de los datos se configuró en modo de "detección automática" con normalización de fuerza y ​​pesos de precisión limma (Vooma). Se seleccionó la categoría de anotación de plataforma generada por NCBI para mostrar en los resultados. Los resultados se obtuvieron en formato delimitado por tabuladores y se exportaron a Microsoft Excel para su posterior análisis.

Los símbolos genéticos de los DEG significativos se usaron para el enriquecimiento funcional del conjunto de genes utilizando las vías KOBAS-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)58,59,60 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)61 con Valor de p ajustado por FDR < 0,05 como límite de significación. Los resultados también se guardaron sin un valor de P ajustado por FDR de < 0,05 para el análisis comparativo.

Los símbolos genéticos de los DEG se usaron para construir la red PPI completa usando STRING (https://string-db.org/). Los DEG se anotaron con términos de ontología de genes en las tres categorías principales, proceso biológico, función molecular y componente celular, así como clúster de red local (STRING), palabras clave (Uniport) y dominios y características de proteínas (InterPro) 62 con medio configuración de confianza (es decir, una puntuación combinada > 0,4) y se guarda como salida de texto tabular breve. Posteriormente, la topología de la red PPI se exportó directamente desde el sitio web de STRING a Cytoscape (v3.9.1)63 (http://www.cytoscape.org/) para su visualización. Los 50 principales nodos centrales y los 15 principales cuellos de botella se identificaron mediante la aplicación del complemento cytoHubba (v0.1) con el método de puntuación Maximal Clique Centrality (MCC)64. Los nodos que interactuaban con fadD se identificaron y estudiaron por separado.

Secuencias proteicas de FadD de B. japonicum (UniProt: A0A0A3XRM6), RpfB de Xcc (UniProt: Q8P9K5), FadD de E. coli (GenBank: UBF39181.1), Agrobacterium tumefaciens (GenBank: CAD0207327.1), Sinorhizobium meliloti SM11 ( GenBank: AEH77411.1) se alinearon usando MUSCLE (MEGA v11)65. La historia evolutiva se infirió usando el método de máxima verosimilitud y el modelo basado en la matriz JTT66, y la distancia de intercambio del vecino más cercano se usó como una opción de inferencia de árbol y se probó mediante 1000 réplicas de arranque. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA v1165. Los dominios proteicos de FadD de B. japonicum y RpfB de Xcc se anotaron utilizando InterProScan67. Las estructuras de proteínas tridimensionales se compararon utilizando TM-align20 y la herramienta RRDistMaps en UCSF Chimera19.

Los archivos de estructura de proteína AlphaFold18 de RpfB (AF-Q8P9K5-F1) y FadD (AF-A0A0A3XRM6-F1) se utilizaron como receptores, y el archivo SDF del factor de señalización difusa (DSF), cis-11-metil-2-dodecenoico acid (PubChem ID: 11469920) se obtuvo de la base de datos PubChem y se usó como ligando. El acoplamiento ciego automático se realizó utilizando CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)21 con 10 repeticiones con parámetros inalterados, y se usaron promedios para las interpretaciones. Se descargaron las estructuras de ligando-receptor de mejor impacto y se guardaron capturas de pantalla de los residuos de contacto para su posterior análisis. Las interacciones receptor-ligando se visualizaron usando Maestro v13.2 gratuito (Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021)68. También se utilizó SWISSDock (http://www.swissdock.ch/docking)23 con el mismo receptor y ligando. También usamos fastDRH (http://cadd.zju.edu.cn/fastdrh/overview)24 para acoplamiento de alta velocidad con el motor de acoplamiento AutoDock Vina, y calculamos la energía MM/PB(GB)SA truncada por estructura y por -descomposición de energía residual basada en múltiples poses. El complejo receptor-ligando obtenido de CB-Dock2 se usó como referencia de bolsillo de unión y luego se seleccionaron 10 números de pose. Para volver a calificar la pose, se seleccionaron el campo de fuerza del receptor ff99SB (con modelo de agua TIP3P) y el campo de fuerza del ligando GAFF2, y la configuración del radio de truncamiento se mantuvo en el valor predeterminado con todos los procedimientos de nueva calificación. Las predicciones de puntos críticos se llevaron a cabo con un campo de fuerza ff99SB inalterado y un radio de truncamiento predeterminado. Para evaluar las poses de acoplamiento, MM/PBSA y MM/GBSA (para producir una descomposición de energía por residuo) se enviaron por separado. Los resultados obtenidos fueron descargados y utilizados para análisis posteriores.

Todas las simulaciones de dinámica molecular (MD) se realizaron utilizando el paquete AMBER 16 con los campos de fuerza ff99SB y GAFF para los receptores RpfB y FadD, y el ligando DSF69. Se utilizó el módulo antecámara de AmberTools para calcular las cargas parciales del ligando utilizando la función semiempírica AM1-BCC según el protocolo estándar70. Los complejos se solvataron con el modelo de agua TIP3P y se neutralizaron mediante la adición de iones Na+ utilizando el script de entrada tLEap del paquete AmberTools. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se modelaron utilizando el método Ewald de malla de partículas71. Se aplicó el algoritmo SHAKE72 para limitar la longitud de los enlaces covalentes, incluidos los átomos de hidrógeno. Se implementó un termostato Langevin para equilibrar la temperatura del sistema a 310 K. Se utilizó un paso de tiempo de 2,0 fs en todas las configuraciones de MD. Para las fases de minimización y equilibrio (conjuntos NVT y NPT), se utilizaron 100.000 pasos y un período de 1 ns, respectivamente. Finalmente, se realizaron simulaciones MD clásicas de 100 ns, sin restricciones como conjunto NPT, para cada uno de los complejos receptor-ligando usando mecánica molecular combinada con el método de Poisson-Boltzmann (MM-PBSA) o Born generalizado (MM-GBSA) aumentado con el término de área de superficie hidrofóbica accesible al solvente73,74. Los modelos de solvatación MM-PBSA/GBSA se aplicaron como un método de estado final posterior al procesamiento para calcular las energías libres (ΔGpbsa y ΔGgbsa).

El conjunto de datos GSE4143 analizado durante el estudio actual está disponible en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE4143.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia bajo Subvenciones para la Investigación Científica (KAKENHI) (números de subvención 18K19674, 18KK0436 y 20H00562) y la Agencia de Japón para la Investigación y el Desarrollo Médicos (números de subvención 20wm0225012h0001 y 21fk0108129h0502 ) a FM. Los autores agradecen los recursos informáticos y el apoyo proporcionados por el profesor Thomas Dandekar y el Centro de TI de la Universität Würzburg con financiación de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través de la subvención n.º INST 93/878-1 FUGG. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Gobierno de la Federación Rusa a través del Programa de Becas y Profesores de ITMO. Los autores reconocen el proyecto FSER-2021-0013 y el programa de becas ITMO por el apoyo a la infraestructura. Agradecemos a Margaret Biswas, PhD, de Edanz (https://jp.edanz.com/ac) por editar un borrador de este manuscrito.

Laboratorio de Quimioinformática, Centro Científico de Infoquímica, Universidad ITMO, San Petersburgo, Federación Rusa

Kunal Dutta y Serguéi Shitiakov

Genómica microbiana y ecología, Instituto IDEC, Universidad de Hiroshima, Higashihiroshima, Japón

fumito maruyama

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KD, SS y FM escribieron el texto principal del manuscrito y KD preparó tablas y figuras. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Kunal Dutta, Sergey Shityakov o Fumito Maruyama.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Dutta, K., Shityakov, S. & Maruyama, F. DSF inactivador RpfB homólogo FadD upregulated en Bradyrhizobium japonicum bajo condiciones limitantes de hierro. Informe científico 13, 8701 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35487-9

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Recibido: 31 diciembre 2022

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35487-9

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